發(fā)布時(shí)間：2020-06-30 07:16

【摘要】：D型流感病毒是新定義的流感病毒家族的一員,于2011年首次從疑似患流感的豬體內(nèi)分離獲得,自2014年以來(lái)在世界各地的牛體內(nèi)被發(fā)現(xiàn),其主要宿主包括豬、牛和其他小反芻動(dòng)物等。此外血清學(xué)證據(jù)也證明了D型流感病毒具有感染人類(lèi)的可能性。同時(shí)該病毒也被認(rèn)為與牛的呼吸道疾病有著密切的關(guān)系。HEF蛋白是D型流感病毒表面唯一的糖蛋白,決定其感染特性。因此對(duì)D型流感病毒基因特性以及HEF蛋白免疫原性的研究為預(yù)防D型流感病毒起到了重要作用。本研究首次嘗試構(gòu)建了D型流感病毒的反向遺傳操作平臺(tái),并且利用昆蟲(chóng)細(xì)胞桿狀病毒系統(tǒng)構(gòu)建了可以作為D型流感病毒有效診斷抗原的HEF蛋白重組桿狀病毒,并利用DNA免疫小鼠獲得了抗HEF蛋白血清。實(shí)驗(yàn)主要分為兩大部分,第一部分是:應(yīng)用A型流感病毒的十三質(zhì)粒反向遺傳系統(tǒng)的pHH21和pCAGGS載體,通過(guò)分子克隆等手段構(gòu)建了D型流感病毒的十二質(zhì)粒反向遺傳操作平臺(tái);同時(shí)依據(jù)廣泛應(yīng)用于A型流感病毒的八質(zhì)粒反向遺傳系統(tǒng)的pBD載體,構(gòu)建了D型流感病毒的七質(zhì)粒反向遺傳系統(tǒng)。分別將兩套系統(tǒng)的重組質(zhì)粒通過(guò)共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中,并將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞上清液對(duì)細(xì)胞以及豚鼠進(jìn)行感染,通過(guò)Real-time RT-PCR方法以及電鏡觀察對(duì)拯救病毒進(jìn)行鑒定。第二部分是:首先利用桿狀病毒載體構(gòu)建了重組HEF蛋白的桿狀病毒系統(tǒng),通過(guò)紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)以及Western Blotting試驗(yàn)鑒定HEF蛋白的免疫原性。同時(shí)應(yīng)用pCAGGS載體構(gòu)建了用于小鼠DNA免疫的高效表達(dá)HEF蛋白的重組質(zhì)粒,并通過(guò)與CpG-ODN分子佐劑進(jìn)行聯(lián)合免疫獲得了相應(yīng)的抗HEF蛋白血清,并通過(guò)血凝抑制試驗(yàn)進(jìn)行抗體效價(jià)的檢測(cè)。研究結(jié)果:(1)成功地構(gòu)建了D型流感病毒的十二和七質(zhì)粒反向遺傳系統(tǒng);(2)通過(guò)七質(zhì)粒反向遺傳系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞成功獲得特異性病毒粒子;(3)拯救的病毒不能夠感染A549、MDCK、ST細(xì)胞,可在豚鼠的上呼吸道中進(jìn)行少量的復(fù)制拷貝,但感染效力較低;(4)成功地構(gòu)建了可以作為D型流感病毒診斷抗原的重組桿狀病毒;(5)通過(guò)質(zhì)粒與CpG-ODN分子佐劑聯(lián)合免疫小鼠制備了具有較高血凝抑制效價(jià)的抗HEF蛋白血清。
【學(xué)位授予單位】：長(zhǎng)春理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R392;R373
【圖文】：

293 份牛血清進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其中 240 份血清的ninhibition，HI）抗體呈陽(yáng)性（效價(jià)≥40），陽(yáng)性率明 IDV 早在 2003 年就已經(jīng)廣泛存在。1~2016 年，在法國(guó)[7]、意大利[8,9]、墨西哥[10]、肯尼亞[個(gè)國(guó)家檢測(cè)到了該病毒的存在。2016 年，Zhai 等[1 個(gè)農(nóng)場(chǎng)中收集了 574 份樣品，其中 324 份動(dòng)物血清本。在230份鼻拭子樣本中，奶牛的IDV陽(yáng)性率為124/55），豬為 36.8%（7/19）。324 份血清樣本檢測(cè)中 7.8%（15/193），水牛為 5.9%（3/51），山羊?yàn)?33.8 也可以羊群之間進(jìn)行傳播。 主要分為 D/OK（D/swine/Oklahoma/1334/2011）與 D/ 2013）兩個(gè)譜系[2]（如圖 1.1），HEF 蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化了一致性，特別是 HEF 蛋白的 212 位置上的氨基酸，而 D/660 譜系的 212 位置為精氨酸。中國(guó)目前僅發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)的幾株 IDV 均不屬于這兩個(gè)譜系。

左右；RNA 片段 3 編碼的是聚合酶蛋白 3（polymerase 3，P3），為聚合酶 A（polymerase A，PA），大小約為 83 KD。PB2 和 PB1 而 P3 蛋白與其他流感病毒不同為中性。它們都是在病毒感染宿主主的細(xì)胞質(zhì)中形成聚合酶復(fù)合體，隨后這種復(fù)合體會(huì)被轉(zhuǎn)運(yùn)到宿主責(zé)催化、修飾病毒所需的基因組 RNA。PB1 蛋白的氨基酸序列被毒各片段中最保守的部分，經(jīng)常用來(lái)評(píng)估流感病毒之間的進(jìn)化關(guān) PB1 蛋白氨基酸序列與其他流感病毒進(jìn)行比較分析后，發(fā)現(xiàn)與 IAV1 蛋白的同源性約為 69%~72%，而與 ICV 的 PB1 蛋白同源性可達(dá)這表明 IDV 與 ICV 的親緣性更近。NA 片段 4 主要負(fù)責(zé)編碼 HEF 蛋白，大小約為 72 KD 左右。在 IAV血凝素蛋白（hemagglutinin，HA）。與 IAV 和 IBV 不同，IDV 同 只具有１個(gè)糖蛋白（如圖 1.2），因此病毒包膜表面的突起見(jiàn)不到蘑白，HEF 蛋白可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體。HEF 蛋白主要是由 H 兩個(gè)亞基組成[19]（如圖 1.3），其中 HEF1 主要負(fù)責(zé)宿主細(xì)胞受體特EF2 主要參與細(xì)胞融合過(guò)程[20]。ab

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前6條

1 李呈軍;陳化蘭;;反向遺傳學(xué)技術(shù)在流感病毒研究和防控中的應(yīng)用[J];中國(guó)科學(xué):生命科學(xué);2015年10期

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4 姜永萍;張洪波;步志高;李呈軍;趙有淑;王秀榮;于康震;陳化蘭;;表達(dá)載體pCAGGS顯著增強(qiáng)禽流感DNA疫苗的免疫保護(hù)效果[J];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué);2006年04期

5 李永強(qiáng);孟慶文;冉多良;于康震;陳化蘭;李賀;吳東來(lái);;表達(dá)帶His-tag的禽流感病毒HA基因桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建及重組病毒的鑒定[J];新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2005年04期

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本文編號(hào)：2735021