【摘要】：順烏頭酸脫羧酶IRG1是定位于線粒體中的一種代謝酶,其以三羧酸循環(huán)中的中間產(chǎn)物順烏頭酸為底物催化產(chǎn)生衣康酸。衣康酸屬于三羧酸循環(huán)中的支線產(chǎn)物,雖然不進入主線的循環(huán)活動中,卻影響著整個線粒體代謝狀態(tài),誘發(fā)一系列生理生化效應(yīng)。衣康酸特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)使其具有強烈的親電子性質(zhì),能夠與蛋白質(zhì)半胱氨酸殘基、谷胱甘肽等多種靶點相互結(jié)合形成特殊的化學(xué)修飾,進而完成一系列精細的調(diào)控活動,往往引起功能元件的失能。近年來發(fā)現(xiàn)IRG1-衣康酸在炎癥調(diào)節(jié)、病原體感染和代謝相關(guān)疾病等方面具有重要功能。而IRG1-衣康酸在病毒感染過程中所發(fā)揮的功能鮮有被報道,我們推測IRG1-衣康酸所引起的代謝狀態(tài)和基因表達譜的變化,以及一些未知的調(diào)節(jié)活動很可能影響著宿主與病毒之間的相互作用。為了認識IRG1-衣康酸與病毒之間的關(guān)系,我們展開了以下研究。第一部分IRG1促進VSV病毒增殖的效應(yīng)我們前期轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示IRG1是病毒感染后表達上調(diào)最為顯著的代謝相關(guān)分子之一,后續(xù)我們研究發(fā)現(xiàn)IRG1對病毒增殖具有調(diào)控效應(yīng)并展開了機制研究。首先我們對IRG1作為病毒誘導(dǎo)基因的性質(zhì)進行驗證,發(fā)現(xiàn)確實多種病毒感染都能夠快速、強烈的誘導(dǎo)IRG1表達。通過RNA干擾技術(shù)和IRG1敲除細胞對IRG1在病毒感染中的功能進行了分析,結(jié)果表明,不同于IRG1通過調(diào)控I型干擾素影響HSV病毒的增殖,IRG1能夠通過I型干擾素非依賴的途徑促進VSV病毒的增殖,即IRG1缺失能夠顯著減少VSV病毒在細胞中的RNA含量和上清中的滴度,同時伴隨著更低的I型干擾素表達。在小鼠體內(nèi)VSV感染模型中,IRG1全身性敲除小鼠各組織臟器中VSV病毒的RNA含量以及病毒載量顯著低于野生型小鼠,但同時血清中細胞因子的含量也更低。此外,在IRF3敲除細胞中干擾IRG1依然能夠抑制VSV病毒的增殖,提示IRG1對病毒增殖的促進作用不依賴于I型干擾素相關(guān)效應(yīng)。最后,我們還證明IRG1穩(wěn)定過表達細胞系中VSV病毒具有更強的增殖能力,也分泌更高水平的I型干擾素。第二部分IRG1通過代謝產(chǎn)物衣康酸促進VSV病毒的增殖我們關(guān)注到IRG1的代謝產(chǎn)物衣康酸,探究其是否在IRG1促進VSV病毒增殖中發(fā)揮作用。通過衣康酸衍生物DMI和OI我們對衣康酸的功能進行了研究,發(fā)現(xiàn)同時給予IRG1干擾組以及對照細胞過量的DMI或OI處理能夠消除IRG1缺失引起的VSV病毒增殖的減弱,在IRG1缺失的骨髓來源巨噬細胞(Bone Marrow Derived Macrophages,BMDMs)和MEF細胞中同樣獲得了相同的結(jié)果。進一步研究表明,DMI和OI能夠通過I型干擾素及下游通路非依賴的途徑促進VSV病毒的增殖,且這種效應(yīng)也廣泛適用于上皮細胞。即DMI和OI處理能夠顯著促進細胞中VSV病毒RNA的含量,同時在IRF3或IFNAR1缺失的細胞中同樣存在相同的促進效應(yīng)。在體內(nèi)VSV感染模型中,給予小鼠DMI或OI的預(yù)處理能夠顯著增加組織臟器中VSV病毒RNA的含量及血清中I型干擾素的濃度。我們還發(fā)現(xiàn)DMI和OI促進VSV病毒內(nèi)吞和胞內(nèi)復(fù)制兩個環(huán)節(jié)。即DMI和OI處理能夠促進VSV病毒感染1小時的病毒進入量,而在IRG1缺陷的細胞中病毒的進入量則減少;我們通過轉(zhuǎn)染病毒RNA繞過病毒內(nèi)吞環(huán)節(jié),DMI和OI依然正調(diào)了胞內(nèi)VSV病毒RNA的含量,相同感染方式下,IRG1缺陷細胞中病毒RNA的含量減少。以上結(jié)果說明IRG1-衣康酸對VSV病毒增殖的促進效應(yīng)作用于病毒生命活動的多個環(huán)節(jié)。第三部分IRG1-衣康酸促進VSV病毒增殖的機制研究我們進一步對IRG1-衣康酸促進VSV病毒增殖的潛在機制進行了分析。已知IRG1-衣康酸可通過抑制琥珀酸脫氫酶(SDH)、促進Nrf2介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄和調(diào)控活性氧簇ROS的產(chǎn)生等途徑發(fā)揮功能,因此我們首先對以上機制進行探索和排除。針對SDH的作用,我們發(fā)現(xiàn)在體外和體內(nèi)實驗中使用琥珀酸脫氫酶經(jīng)典抑制劑DMM處理并不顯著影響VSV病毒的增殖。此外,DMM也不會影響DMI和OI對VSV病毒增殖的促進效應(yīng),表明衣康酸并不通過SDH發(fā)揮功能。針對Nrf2的作用,我們在干擾Nrf2之后再使用DMI和OI處理細胞,發(fā)現(xiàn)干擾Nrf2之后并不會對DMI和OI的效應(yīng)產(chǎn)生影響,表明IRG1-衣康酸也不通過Nrf2發(fā)揮效應(yīng)。針對ROS的產(chǎn)生,我們的研究表明,DMI和OI處理能夠抑制細胞本底ROS的產(chǎn)生,但是進一步研究發(fā)現(xiàn)清除細胞中的ROS之后,并不會影響DMI和OI對病毒增殖的效應(yīng),表明IRG1-衣康酸并不通過ROS發(fā)揮效應(yīng)。據(jù)此,已知IRG1-衣康酸發(fā)揮作用的三條主要途徑均被排除。為了尋找IRG1-衣康酸促進VSV病毒增殖的關(guān)鍵機制,我們對IRG1敲除以及對照細胞進行了RNA-seq轉(zhuǎn)錄組測序,在差異基因的富集結(jié)果中我們發(fā)現(xiàn),IRG1敲除之后會引起大量氧化磷酸化及脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的變化。對氧化磷酸化進一步分析顯示,衣康酸能夠促進氧化磷酸化相關(guān)基因的上調(diào)表達,細胞內(nèi)的ATP含量也明顯升高。ATP抑制劑處理能夠部分逆轉(zhuǎn)DMI和OI的效應(yīng);干擾介導(dǎo)電子傳遞鏈基因表達的轉(zhuǎn)錄因子之后,雖然抑制了VSV病毒的增殖,但卻不能完全消除DMI和OI引起的病毒增殖差異。以上結(jié)果表明能量代謝的上調(diào)可能在衣康酸促進VSV病毒增殖的效應(yīng)中起到一定的輔助作用,但并不是主導(dǎo)因素。另一方面,我們分析了脂質(zhì)代謝在IRG1-衣康酸促進VSV病毒增殖過程中是否發(fā)揮作用。首先,抑制脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄能夠減弱DMI和OI的效應(yīng),而抑制膽固醇合成后幾乎完全阻斷了DMI和OI對VSV病毒增殖的促進作用,因此我們關(guān)注了膽固醇合成過程中發(fā)生的變化。膽固醇合成通路上主要產(chǎn)生類膽固醇和類異戊二烯兩類脂質(zhì)物質(zhì),且都與病毒增殖具有一定相關(guān)性。我們進一步研究發(fā)現(xiàn),膽固醇及其衍生物并未參與調(diào)控VSV病毒的增殖,而產(chǎn)生類異戊二烯物質(zhì)-雙r{牛兒焦磷酸(GGDP)的支線代謝通路可能發(fā)揮關(guān)鍵作用。外源補充GGDP能夠逆轉(zhuǎn)抑制膽固醇合成之后DMI和OI效應(yīng)的喪失,說明衣康酸發(fā)揮功能的環(huán)節(jié)處于GGDP下游。GGDP能夠介導(dǎo)特殊的代謝修飾異戊烯化,往往對病毒的增殖具有正向調(diào)節(jié)作用。使用異戊烯化抑制劑能夠顯著阻斷DMI和OI對病毒的效應(yīng),說明衣康酸的效應(yīng)極大程度依賴于異戊烯化。通過對異戊烯化過程中相關(guān)功能酶的定量檢測發(fā)現(xiàn),DMI和OI能夠顯著促進這些基因的表達,同時異戊烯化介導(dǎo)的小GTPase的膜轉(zhuǎn)位活動也顯著增強。綜上所述,在病毒感染時IRG1能夠被快速且強烈的誘導(dǎo)表達,通過其代謝酶活性催化產(chǎn)生大量的衣康酸,衣康酸通過調(diào)節(jié)氧化呼吸以及異戊烯化相關(guān)基因的高表達,提高細胞內(nèi)ATP的含量,正調(diào)異戊烯化修飾的生化活動,兩方面共同促進了VSV病毒在宿主中的增殖。本課題對IRG1-衣康酸在病毒感染中的作用及其機制上提出了新的認識,進一步揭示了IRG1-衣康酸發(fā)揮效應(yīng)的方式,也為臨床上相關(guān)疾病的治療提供新的靶點和思路。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R373
【圖文】：

順烏頭酸脫羧酶 IRG1 調(diào)控病毒增殖的效應(yīng)及其機制有明顯變化的代謝相關(guān)分子，我們對 VSV 和 HSV 病毒感染前后的 BMD組測序分析。VSV 病毒屬于單股負鏈 RNA 病毒，HSV 屬于雙鏈 DNA 病序結(jié)果，有 32 個代謝相關(guān)基因在兩種病毒感染后表達都顯著上調(diào)，有 11關(guān)基因在兩種病毒感染后表達都顯著下調(diào)（圖 1-2 A），我們選取了其中顯的 10 個基因作為候選分子（圖 1-2 B，C），通過 RNA 干擾實驗探究染中的潛在效應(yīng)。其中，基因 Acod1 引起了我們的關(guān)注，其在兩種病毒刺表達極為顯著（圖 1-2 B，C）�；� Acod1 也稱作 Irg1，是順烏頭酸脫編碼基因，我們實驗室前期研究發(fā)現(xiàn) IRG1 能夠通過調(diào)控 ROS，發(fā)揮炎[43]。除此之外，我們課題設(shè)計初期關(guān)注于抗病毒天然免疫信號通路中關(guān)鍵AVS[41]的相互結(jié)合蛋白。通過免疫共沉淀和質(zhì)譜技術(shù)，我們對 MAVS 的白進行了鑒定，其中發(fā)現(xiàn) IRG1 與 MAVS 之間存在潛在的相互結(jié)合關(guān)系，提示 IRG1 可能在病毒感染過程中具有潛在的功能。

無論是 RNA 病毒（VSV 和 Sev）還是 DNA 病毒（HSV，VACV）都能夠在腹腔巨噬細胞（PeritonealMacrophages,PMs）中誘導(dǎo) IRG1 高表達（圖 1-3A）。我們又對病毒感染后 IRG1 基因表達的動態(tài)變化進行了檢測，以 VSV 感染為例，在病毒感染約 1 小時的時候 IRG1 的表達就明顯上調(diào)（圖 1-3B），說明 IRG1 對于病毒感染的應(yīng)答是極其迅速的。而已有文獻報道包括 I 型干擾素在內(nèi)的多種細胞因子都能夠誘導(dǎo) IRG1 的表達[37, 43]，因此我們也同時檢測了 Ifnb1 和 Il6 的表達。有趣的是，IRG1 在病毒感染早期的高表達明顯提前于 I 型干擾素以及炎性因子 Il6 的表達（圖 1-3B），因此我們推測 IRG1 可能在病毒感染早期獨立于 I 型干擾素信號發(fā)揮著一定的作用。在體內(nèi)實驗中，我們首先檢測了在非病毒感染狀態(tài)下 IRG1 在各組織臟器中的表達分布情況，如圖（圖 1-3C）所示，IRG1 廣泛表達于各個組織臟器中，其中肝臟中的表達明顯高于其他臟器。進一步，我們檢測了在 VSV 和 HSV 病毒感染下 IRG1 在組織中的表達情況，結(jié)果顯示（圖 1-3D，E），在 VSV 和 HSV 病毒感染 12 小時的時候肺臟、肝臟和脾臟中的 IRG1 明顯高表達，24 小時時則恢復(fù)到感染前的表達水平。上述 IRG1 表達情況表明 IRG1 在各組織臟器中廣泛表達，且病毒感染能夠強烈且迅速的誘導(dǎo) IRG1 的表達，提示其很可能在病毒感染過程中發(fā)揮著一定的功能。

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本文編號：2730671