【摘要】：目的:本文旨在研究體外條件下,轉(zhuǎn)錄因子myc相關(guān)鋅指蛋白(myc-associated zinc finger protein,MAZ)及SP1對人類1號染色體開放閱讀框109(C1orf109)基因的轉(zhuǎn)錄表達調(diào)控。該研究的目的是回答以下問題:是否存在SP1之外的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)C1orf109基因的表達;C1orf109的表達是否受其產(chǎn)物磷酸化狀態(tài)的反饋調(diào)節(jié);C1orf109的表達是否存在另外的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。方法:體外條件下,凝膠電泳遷移實驗(EMSA)鑒定C1orf109基因啟動子上MAZ和SP1的順式作用元件,包括突變寡核苷酸的競爭反應(yīng)和特異性抗體超遷移實驗;為了研究MAZ和SP1對C1orf109啟動子的有效性,我們將C1orf109基因上游2.5kb的片段亞克隆到(綠色熒光)EGFP表達載體中,并且測序驗證構(gòu)建的載體;利用Lipofectamine ~(TM)3000 Reagent在不同條件下,用C1orf109啟動子驅(qū)動的不同載體轉(zhuǎn)染Hela細胞;轉(zhuǎn)染24h后,流式細胞儀或激光共聚焦顯微鏡檢測EGFP的表達情況;找到新的轉(zhuǎn)錄子后,將C1orf109啟動子區(qū)和新轉(zhuǎn)錄子序列亞克隆到EGFP載體上;實時定量PCR(RT-PCR)用于檢測結(jié)果是否在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上是否一致,并且檢測由C1orf109啟動子驅(qū)動的兩種轉(zhuǎn)錄子。結(jié)果:1.MAZ在C1orf109啟動子區(qū)有結(jié)合位點,且MAZ與SP1有共享結(jié)合位點的情況[1]。2.轉(zhuǎn)錄因子MAZ和SP1均抑制基因C1orf109的轉(zhuǎn)錄表達,且SP1的抑制作用強于MAZ,MAZ和SP1對C1orf109的抑制作用機制表現(xiàn)復雜~([1])。3.特異性抑制MAPK磷酸化途徑,轉(zhuǎn)錄因子MAZ和SP1對調(diào)控C1orf109的轉(zhuǎn)錄表達未見影響。4.體外條件下,選擇性抑制CK_2激酶的活性影響C1orf109的轉(zhuǎn)錄表達。5.C1orf109啟動子區(qū)和新的轉(zhuǎn)錄子驅(qū)動的綠色熒光報道載體轉(zhuǎn)染Hela細胞后檢測到綠色熒光蛋白的表達,表明C1orf109的表達可能有新的轉(zhuǎn)錄子。6.初步的RT-PCR結(jié)果顯示,分別用構(gòu)建的C1orf109兩種表達載體轉(zhuǎn)染Hela細胞后,mRNA表達水平均增高。結(jié)論:MAZ與SP1兩個轉(zhuǎn)錄因子共調(diào)控C1orf109在生理及病理條件的表達,調(diào)控方向一致,這種冗余機制調(diào)控方式的存在提示該基因的精確表達調(diào)控對于細胞行使其生物學功能具有重要意義~([1]);且MAZ和SP1對C1orf109轉(zhuǎn)錄表達的調(diào)控是一種復雜且重要的機制。選擇性抑制CK_2激酶的活性影響C1orf109的轉(zhuǎn)錄表達,其表達可能與CK_2激酶的磷酸化之間存在反饋作用。C1orf109的表達可能有新的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。初步的RT-PCR結(jié)果為是否成功構(gòu)建C1orf109表達載體提供重要數(shù)據(jù)參考�？傊�,以上工作為進一步探究C1orf109基因新產(chǎn)物的作用及C1orf109異常表達引起腫瘤的病理機制提供理論基礎(chǔ)。
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R346
【圖文】：

圖 2-1 實驗思路示意圖圖 2-1，利用 PROMO 軟件（版本 3.0.2）對 C1orf109 基因轉(zhuǎn)錄起始點上p～-1bp 的 DNA 序列進行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點預測，篩選出可疑序列合成探針 EMSA（包括競爭實驗、超遷移實驗）分析是否有 MAZ 結(jié)合點，MAZ、S

圖 2-3 MAZ 啟動子驅(qū)動的熒光報告載體主要結(jié)構(gòu)示意圖2. Xba1+EcoR1 酶切 MAZ 啟動子驅(qū)動的熒光報道載體，去掉 MAZ 基因的啟動區(qū)序列，注意 37℃酶切 30min 左右，以保證產(chǎn)物酶切完全；3. 上述 2 中酶切終產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分離后，膠回收需要片段，測濃度 4℃保備用；4. 將定制的 yp-96 連入酶點 PF 及 yp-97 連入酶點 PR 合成雙鏈，與上述 3 中的回收產(chǎn)物用 T4 連接酶 16℃水浴過夜連接；5. 將連接體系全部轉(zhuǎn)化進制備好的大腸桿菌感受態(tài)細胞，放入 SOC 培養(yǎng)基，37℃，00r/min 水浴擴增 1.5h 左右后，收集細菌；6. 分別將每個樣品在 LB-Amp 固體培養(yǎng)基涂板，放細菌培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng) 8h，以篩選 Amp 抗性的菌落；7. 上述 6 中的每個樣品板都需挑取 3-5 個單克隆，LB-Amp 液體培養(yǎng)基 37℃，200r/min 水浴培養(yǎng)過夜，質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒后酶切+瓊脂糖凝膠電泳驗證，

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 王雪偉;任劍波;王小怡;王博;高哲;郭大瑋;;轉(zhuǎn)錄因子MAZ對c1orf109基因轉(zhuǎn)錄表達調(diào)控的體外研究[J];中國病理生理雜志;2018年01期

2 吳克復;細胞因子和轉(zhuǎn)錄因子的功能豐余性及其意義[J];中國實驗血液學雜志;2003年04期

本文編號：2730140