【摘要】：目的:本文旨在研究體外條件下,轉(zhuǎn)錄因子myc相關(guān)鋅指蛋白(myc-associated zinc finger protein,MAZ)及SP1對(duì)人類(lèi)1號(hào)染色體開(kāi)放閱讀框109(C1orf109)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控。該研究的目的是回答以下問(wèn)題:是否存在SP1之外的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)C1orf109基因的表達(dá);C1orf109的表達(dá)是否受其產(chǎn)物磷酸化狀態(tài)的反饋調(diào)節(jié);C1orf109的表達(dá)是否存在另外的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。方法:體外條件下,凝膠電泳遷移實(shí)驗(yàn)(EMSA)鑒定C1orf109基因啟動(dòng)子上MAZ和SP1的順式作用元件,包括突變寡核苷酸的競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)和特異性抗體超遷移實(shí)驗(yàn);為了研究MAZ和SP1對(duì)C1orf109啟動(dòng)子的有效性,我們將C1orf109基因上游2.5kb的片段亞克隆到(綠色熒光)EGFP表達(dá)載體中,并且測(cè)序驗(yàn)證構(gòu)建的載體;利用Lipofectamine ~(TM)3000 Reagent在不同條件下,用C1orf109啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的不同載體轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞;轉(zhuǎn)染24h后,流式細(xì)胞儀或激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)EGFP的表達(dá)情況;找到新的轉(zhuǎn)錄子后,將C1orf109啟動(dòng)子區(qū)和新轉(zhuǎn)錄子序列亞克隆到EGFP載體上;實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)用于檢測(cè)結(jié)果是否在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上是否一致,并且檢測(cè)由C1orf109啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的兩種轉(zhuǎn)錄子。結(jié)果:1.MAZ在C1orf109啟動(dòng)子區(qū)有結(jié)合位點(diǎn),且MAZ與SP1有共享結(jié)合位點(diǎn)的情況[1]。2.轉(zhuǎn)錄因子MAZ和SP1均抑制基因C1orf109的轉(zhuǎn)錄表達(dá),且SP1的抑制作用強(qiáng)于MAZ,MAZ和SP1對(duì)C1orf109的抑制作用機(jī)制表現(xiàn)復(fù)雜~([1])。3.特異性抑制MAPK磷酸化途徑,轉(zhuǎn)錄因子MAZ和SP1對(duì)調(diào)控C1orf109的轉(zhuǎn)錄表達(dá)未見(jiàn)影響。4.體外條件下,選擇性抑制CK_2激酶的活性影響C1orf109的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。5.C1orf109啟動(dòng)子區(qū)和新的轉(zhuǎn)錄子驅(qū)動(dòng)的綠色熒光報(bào)道載體轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后檢測(cè)到綠色熒光蛋白的表達(dá),表明C1orf109的表達(dá)可能有新的轉(zhuǎn)錄子。6.初步的RT-PCR結(jié)果顯示,分別用構(gòu)建的C1orf109兩種表達(dá)載體轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后,mRNA表達(dá)水平均增高。結(jié)論:MAZ與SP1兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子共調(diào)控C1orf109在生理及病理?xiàng)l件的表達(dá),調(diào)控方向一致,這種冗余機(jī)制調(diào)控方式的存在提示該基因的精確表達(dá)調(diào)控對(duì)于細(xì)胞行使其生物學(xué)功能具有重要意義~([1]);且MAZ和SP1對(duì)C1orf109轉(zhuǎn)錄表達(dá)的調(diào)控是一種復(fù)雜且重要的機(jī)制。選擇性抑制CK_2激酶的活性影響C1orf109的轉(zhuǎn)錄表達(dá),其表達(dá)可能與CK_2激酶的磷酸化之間存在反饋?zhàn)饔�。C1orf109的表達(dá)可能有新的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。初步的RT-PCR結(jié)果為是否成功構(gòu)建C1orf109表達(dá)載體提供重要數(shù)據(jù)參考�？傊�,以上工作為進(jìn)一步探究C1orf109基因新產(chǎn)物的作用及C1orf109異常表達(dá)引起腫瘤的病理機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R346
【圖文】：

圖 2-1 實(shí)驗(yàn)思路示意圖圖 2-1，利用 PROMO 軟件（版本 3.0.2）對(duì) C1orf109 基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上p～-1bp 的 DNA 序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)，篩選出可疑序列合成探針 EMSA（包括競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)、超遷移實(shí)驗(yàn)）分析是否有 MAZ 結(jié)合點(diǎn)，MAZ、S

圖 2-3 MAZ 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光報(bào)告載體主要結(jié)構(gòu)示意圖2. Xba1+EcoR1 酶切 MAZ 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光報(bào)道載體，去掉 MAZ 基因的啟動(dòng)區(qū)序列，注意 37℃酶切 30min 左右，以保證產(chǎn)物酶切完全；3. 上述 2 中酶切終產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分離后，膠回收需要片段，測(cè)濃度 4℃保備用；4. 將定制的 yp-96 連入酶點(diǎn) PF 及 yp-97 連入酶點(diǎn) PR 合成雙鏈，與上述 3 中的回收產(chǎn)物用 T4 連接酶 16℃水浴過(guò)夜連接；5. 將連接體系全部轉(zhuǎn)化進(jìn)制備好的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，放入 SOC 培養(yǎng)基，37℃，00r/min 水浴擴(kuò)增 1.5h 左右后，收集細(xì)菌；6. 分別將每個(gè)樣品在 LB-Amp 固體培養(yǎng)基涂板，放細(xì)菌培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng) 8h，以篩選 Amp 抗性的菌落；7. 上述 6 中的每個(gè)樣品板都需挑取 3-5 個(gè)單克隆，LB-Amp 液體培養(yǎng)基 37℃，200r/min 水浴培養(yǎng)過(guò)夜，質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒后酶切+瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 王雪偉;任劍波;王小怡;王博;高哲;郭大瑋;;轉(zhuǎn)錄因子MAZ對(duì)c1orf109基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控的體外研究[J];中國(guó)病理生理雜志;2018年01期

2 吳克復(fù);細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子的功能豐余性及其意義[J];中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志;2003年04期

本文編號(hào)：2730140