【摘要】：帕金森病(Parkinson's disease,PD)是一種常見于中老年人的黑質(zhì)紋狀體通路變性導(dǎo)致的運動障礙疾病。目前,PD的治療只局限于癥狀的緩解,無法阻止神經(jīng)元的持續(xù)變性。尋找阻止疾病進(jìn)展的有效藥物一直是國際關(guān)注的熱點。氧化應(yīng)激和自噬在PD發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用,且兩者之間存在復(fù)雜的作用網(wǎng)絡(luò)。天然抗氧化劑α-硫辛酸(α-lipoic acid,ALA)可以通過抗氧化應(yīng)激保護(hù)神經(jīng)元,但對PD自噬的調(diào)節(jié)作用尚鮮有報道。本課題將結(jié)合PD細(xì)胞和動物模型深入研究氧化應(yīng)激和自噬的相互作用機(jī)制,及ALA通過活性氧(reactive oxygen species,ROS)-腺嘌呤核糖核苷酸依賴的蛋白激酶(adenosine monophosphateactivated protein kinase,AMPK)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,m TOR)及相關(guān)信號通路影響自噬的機(jī)制。本研究提出了ALA對于PD自噬的影響,并深入探討其作用機(jī)制,將有助于深刻理解PD氧化應(yīng)激和自噬的相互作用機(jī)制,為研發(fā)安全高效的PD藥物治療提供理論和實驗依據(jù)。目的1.觀察不同濃度及不同時間點的6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)對人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y)的存活率的影響,確定PD細(xì)胞模型的合適濃度及時間范圍;觀察ALA對6-OHDA誘導(dǎo)的帕金森病細(xì)胞模型的存活率、凋亡率、氧化應(yīng)激水平的影響。2.觀察ALA對6-OHDA誘導(dǎo)的帕金森病細(xì)胞模型自噬-溶酶體途徑相關(guān)蛋白微管相關(guān)蛋白輕鏈3(Microtubule-associated protein l 1ight chain3,LC3)及自噬上游調(diào)控蛋白m TOR、AMPK表達(dá)水平影響。3.觀察ALA對6-OHDA誘導(dǎo)的帕金森病大鼠神經(jīng)元的保護(hù)作用。方法1.根據(jù)不同濃度及作用不同時間6-OHDA對SH-SY5Y細(xì)胞活性的影響,選擇合適的6-OHDA處理濃度及時間。利用SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)過6-OHDA處理制作帕金森細(xì)胞模型,再給予ALA進(jìn)行干預(yù)。采用CCK-8法測定細(xì)胞活性,AnnexinⅤ與PI共染法檢測細(xì)胞凋亡,熒光探針DCFH-DA檢測細(xì)胞內(nèi)ROS的表達(dá)。2.GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染觀察GFP標(biāo)記的LC3蛋白在帕金森細(xì)胞模型內(nèi)的定位;Western blot法分析細(xì)胞內(nèi)LC3-II、m TOR、磷酸化m TOR(phosph-m TOR,pm TOR)、AMPK、磷酸化AMPK(phosph-AMPK,p-AMPK)蛋白表達(dá)水平的變化。3.應(yīng)用6-OHDA腦內(nèi)注射建立PD大鼠模型,3周后進(jìn)行各組大鼠的行為學(xué)檢測,選取成功的大鼠模型,給予ALA藥物干預(yù)2周后進(jìn)行行為學(xué)檢測,中腦黑質(zhì)HE染色觀察細(xì)胞形態(tài),免疫組化法檢測黑質(zhì)酪氨酸羥化酶(throsine hydroxylase,TH)含量。最后均使用SPSS 22.0軟件對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果1.6-OHDA對細(xì)胞活性產(chǎn)生了抑制作用,并且呈時間和濃度依賴性;6-OHDA組與對照組相比,細(xì)胞活性降低(P0.01),細(xì)胞凋亡率升高(P0.01),氧化應(yīng)激水平升高(P0.01)。與對照組相比,ALA組的上述指標(biāo)均無明顯變化;與6-OHDA組相比,ALA+6-OHDA組的細(xì)胞活性升高(P0.05),細(xì)胞凋亡率降低(P0.01)、氧化應(yīng)激水平降低(P0.01)。2.6-OHDA組與對照組相比,LC3-II的表達(dá)升高(P0.05),其中6h時表達(dá)最高;6-OHDA處理SH-SY5Y細(xì)胞12h,p-AMPK的表達(dá)升高(P0.05),p-m TOR的表達(dá)降低(P0.05);與對照組相比,ALA組的上述指標(biāo)均無明顯變化;與6-OHDA組相比,ALA+6-OHDA組的LC3-II的表達(dá)降低(P0.05),p-AMPK的表達(dá)降低(P0.05),p-m TOR的表達(dá)升高(P0.05)。3.6-OHDA組與對照組相比,大鼠的行為能力明顯降低,中腦黑質(zhì)TH陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯減少(P0.05);與6-OHDA組相比,6-OHDA+ALA組大鼠的行為能力顯著性增高,黑質(zhì)中TH神經(jīng)元的數(shù)量增加(P0.05)。ALA低劑量組和高劑量組相比大鼠的行為能力和TH神經(jīng)元數(shù)量無明顯差異(P0.05)。結(jié)論1.6-OHDA誘導(dǎo)了SH-SY5Y細(xì)胞的氧化應(yīng)激和自噬,降低了細(xì)胞活性,ALA可能通過抑制氧化應(yīng)激、抑制AMPK/m TOR通路介導(dǎo)的自噬減輕了6-OHDA誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化損傷。2.ALA對6-OHDA誘導(dǎo)的帕金森病大鼠神經(jīng)元有保護(hù)作用。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R742.5;R-332
【圖文】：

12注:A: 流式檢測各組 SH-SY5Y 細(xì)胞的凋亡；B: 流式結(jié)果的圖 4 ALA 對 6-OHDA 誘導(dǎo) SH-SY5Y 細(xì)胞凋亡的影響（與對組比較bP <0.01）Fig 4 Effect of ALA on 6-OHDA induced SH-SY5Y cell apop

天津醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文 1.2.4 6-OHDA 對 SH-SY5Y 細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響和 AL如圖 5 所示 6-OHDA 組 SH-SY5Y 細(xì)胞 ROS 水組升高（P<0.01）；ALA 組細(xì)胞 ROS 水平較對照組組 SH-SY5Y 細(xì)胞 ROS 水平為 379.31±61.01%，較 6但較對照組升高（P<0.01）。ControlALAA

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本文編號：2730102