【摘要】：研究背景:Spinster同源蛋白2(spinster homolog 2,SPNS2)是近期被發(fā)現(xiàn)的1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate,S1P)的膜轉(zhuǎn)運蛋白,可通過“inside-out”途徑將細胞內(nèi)合成的S1P向細胞外分泌,并作用于五種S1P受體(S1P receptors1-5,S1PR1-5)發(fā)揮廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。SPNS2是目前唯一被證實可在體內(nèi)介導(dǎo)S1P分泌的膜轉(zhuǎn)運蛋白,該分子的發(fā)現(xiàn)首次闡明了體內(nèi)S1P生理水平的構(gòu)建和維持機制。早期研究報道了ATP結(jié)合盒(ATP-binding cassette,ABC)轉(zhuǎn)運蛋白可能具有分泌S1P的功能,但其作用僅通過體外實驗論證,而在ABC轉(zhuǎn)運蛋白缺失的動物中并未檢測到S1P濃度的改變,因此并沒有直接證據(jù)證明ABC轉(zhuǎn)運蛋白參與了S1P在體內(nèi)的分泌過程。與之不同,多項研究證明SPNS2轉(zhuǎn)運蛋白可通過調(diào)控體內(nèi)S1P水平,影響多種病理生理學(xué)過程,包括心肌前體細胞遷移、血漿S1P水平維持、血管發(fā)生、淋巴細胞遷移、聽覺維持、肺泡上皮細胞病理生理調(diào)節(jié)以及肝臟纖維化等。然而,目前尚無研究證實SPNS2轉(zhuǎn)運蛋白可參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)控。研究目的:本實驗室現(xiàn)擁有一株由egfp基因插入引起spns2基因突變的大鼠品系,該動物表現(xiàn)出明顯的眼周表型,體現(xiàn)為出生時眼瞼不閉合(eyelid-open at birth,EOB)及繼發(fā)的角膜混濁、瞼球粘連等。此外,我們發(fā)現(xiàn)spns2突變大鼠還表現(xiàn)出視網(wǎng)膜層狀結(jié)構(gòu)紊亂、視網(wǎng)膜血管發(fā)育異常等眼內(nèi)表型,提示SPNS2轉(zhuǎn)運蛋白可能參與視網(wǎng)膜的形態(tài)發(fā)生過程。因此,本課題通過分析spns2突變大鼠的眼部表型,闡明SPNS2轉(zhuǎn)運蛋白在視網(wǎng)膜發(fā)育過程中的功能和作用機制,為探討其在疾病治療中的潛在價值提供理論依據(jù)。研究結(jié)果:Spns2突變大鼠視網(wǎng)膜層狀結(jié)構(gòu)破壞出現(xiàn)于新生期,由頂側(cè)的微小褶皺迅速發(fā)展為外核層花環(huán)樣結(jié)構(gòu)。通過EOB表型挽救實驗和制作人工EOB模型動物兩種方法,我們證明了EOB表型不是引起新生spns2突變動物視網(wǎng)膜層狀結(jié)構(gòu)改變的原因。這種異常的視網(wǎng)膜形態(tài)發(fā)生過程是由視網(wǎng)膜前體細胞(retinal progenitor cells,RPCs)過度增殖引起的,表現(xiàn)為對稱性有絲分裂增多和細胞周期退出延遲,這一現(xiàn)象與頂側(cè)連接(apical junction,AJ)復(fù)合體的表達、分布異常有關(guān)。首先,在新生動物中spns2突變視網(wǎng)膜極化分子表達和分布異常的發(fā)生早于層狀結(jié)構(gòu)的改變,提示RPC極性的維持是SPNS2轉(zhuǎn)運蛋白調(diào)控新生期視網(wǎng)膜發(fā)育的重要機制之一,RPCs極性缺失可能是spns2突變視網(wǎng)膜層狀結(jié)構(gòu)改變的始動因素。由于細胞極性的缺失,spns2突變視網(wǎng)膜中出現(xiàn)大量異位有絲分裂的細胞,粘附分子在大部分異位分裂的RPCs中均勻分布在細胞核周圍,并等量分配到兩個新生的子細胞中。粘附分子在子細胞中的分配是決定子細胞命運的重要因素,其平均分配可導(dǎo)致更多前體細胞的產(chǎn)生,這是spns2突變視網(wǎng)膜發(fā)生過度增殖的潛在機制之一。第二,生理條件下RPCs中粘附分子的表達量在視網(wǎng)膜發(fā)育后期顯著降低,以促進細胞周期的退出,其分布由核周分布轉(zhuǎn)變?yōu)轫攤?cè)線性分布。我們發(fā)現(xiàn)SPNS2/S1PRs信號通路在下調(diào)粘附分子表達水平、促進細胞周期退出的過程中發(fā)揮重要作用。SPNS2轉(zhuǎn)運蛋白的缺失導(dǎo)致粘附分子在視網(wǎng)膜發(fā)育后期異常高表達,阻礙了RPCs退出細胞周期并分化為成熟神經(jīng)元,這是導(dǎo)致spns2突變視網(wǎng)膜RPCs過度增殖的另一潛在機制。第三,SPNS2轉(zhuǎn)運蛋白通過分泌S1P激活Rac1信號通路,誘導(dǎo)有絲分裂后期RPCs遷移至不同位置,并分化為合適的神經(jīng)元類型。在spns2突變大鼠視網(wǎng)膜中有絲分裂后期RPCs的遷移過程受阻,新生神經(jīng)元滯留于外核層并分化為視桿細胞,導(dǎo)致spns2突變視網(wǎng)膜外核層細胞數(shù)量顯著增多,視網(wǎng)膜層狀結(jié)構(gòu)破壞。我們發(fā)現(xiàn)S1PR3可能是調(diào)節(jié)出生后視網(wǎng)膜發(fā)育過程的主要受體,在spns2~(+/+)的視網(wǎng)膜中下調(diào)s1pr3的表達水平可模擬SPNS2轉(zhuǎn)運蛋白缺失的視網(wǎng)膜表型。結(jié)論:本課題首次提出了SPNS2/S1PR3信號通路參與調(diào)控出生后視網(wǎng)膜發(fā)育過程,該通路對于維持RPCs細胞極性、促進RPCs退出細胞周期、誘導(dǎo)有絲分裂后期新生神經(jīng)元的遷移等過程發(fā)揮重要作用。該研究成果可為臨床治療視網(wǎng)膜腫瘤、眼創(chuàng)傷、血管性眼病等提供新的治療策略,并為探索SPNS2轉(zhuǎn)運蛋白在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的功能提供理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R339.146
【圖文】：

空軍軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文PCs 的細胞核在上皮內(nèi)縱向遷移，這一lear migration, INM）。在 INM 過程中， 1）。當(dāng)細胞核位于頂側(cè)（近色素上皮而有絲分裂后期產(chǎn)生的子細胞則表現(xiàn)出 期，細胞核繼續(xù)向基底側(cè)（近晶狀體側(cè)開始下一輪有絲分裂；其余細胞胞體與的神經(jīng)元 (48, 61)。INM 同樣存在于腦本模式。

空軍軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文另一方面，AJ 復(fù)合物的表達水平直接影響神經(jīng)前體細胞退出細胞周期。前期實驗證明，AJ 復(fù)合物相關(guān)蛋白的持續(xù)高表達可引起細胞周期延長、神經(jīng)前體細胞過度增殖以及神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)破壞 (47, 48)；相反，下調(diào) AJ 復(fù)合物表達水平則導(dǎo)致神經(jīng)前體細胞的不成熟分化 (72)。綜上所述，AJ 復(fù)合物是調(diào)控神經(jīng)前體細胞行為、維持神經(jīng)上皮正常形態(tài)的關(guān)鍵分子結(jié)構(gòu)，是研究生理和病理條件下中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程的重要靶點。

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本文編號：2729684