【摘要】：背景:免疫穩(wěn)態(tài)是機(jī)體免疫系統(tǒng)與外界、免疫系統(tǒng)內(nèi)部各組分之間相互作用而形成和維持的平衡狀態(tài),是維持機(jī)體生命健康的關(guān)鍵因素,感染性疾病、自身免疫病和腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展均與免疫穩(wěn)態(tài)失衡密切相關(guān)。近年來,微環(huán)境改變、免疫穩(wěn)態(tài)失衡與疾病發(fā)生發(fā)展三者之間的關(guān)系受到人們的重視,已經(jīng)成為生命科學(xué)領(lǐng)域的重點(diǎn)關(guān)注方向。巨噬細(xì)胞是重要的天然免疫細(xì)胞和抗原遞呈細(xì)胞,極化狀態(tài)是其參與免疫穩(wěn)態(tài)和微環(huán)境調(diào)控的重要機(jī)制。巨噬細(xì)胞至少有兩種不同的極化狀態(tài),即主導(dǎo)“促炎和殺傷”功能的M1型極化和主導(dǎo)“抑炎和修復(fù)”功能的M2型極化?越來越多的研究顯示,巨噬細(xì)胞的極化失衡是多種免疫相關(guān)疾病如自身免疫病、腫瘤等疾病的關(guān)鍵病理因素。巨噬細(xì)胞極化調(diào)控靶分子的探索研究成為新的研究熱點(diǎn)。雖然已知Stat1、Stat3、Stat6、SOCS1、IRF4和IRF5等信號分子,以及多種mi RNA等均參與了巨噬細(xì)胞的極化調(diào)控,但在不同的微環(huán)境下不同的受體分子如何激活上述極化調(diào)控信號尚不十分清楚。尋找新型巨噬細(xì)胞調(diào)控分子,明確其調(diào)控機(jī)制,對于實(shí)現(xiàn)靶向巨噬細(xì)胞的免疫干預(yù)具有重要的理論及現(xiàn)實(shí)意義。T細(xì)胞免疫球蛋白及粘蛋白-3(T-cell Ig-mucin-3,Tim-3)是2002年鑒定出的新型免疫調(diào)控蛋白,主要表達(dá)在活化的Th1、Th17和Tc1細(xì)胞上。Tim-3與其配體半乳凝素-9(Galectin-9,Gal-9)結(jié)合后能通過誘導(dǎo)凋亡等機(jī)制抑制上述T細(xì)胞的功能,維持體內(nèi)免疫耐受,被認(rèn)為是新一代的免疫調(diào)控靶點(diǎn)。隨著研究的不斷深入,我們課題組及其他課題組發(fā)現(xiàn)Tim-3也表達(dá)在天然免疫細(xì)胞上。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)Tim-3在膿毒血癥中的表達(dá)或功能異常與體內(nèi)巨噬細(xì)胞的過度活化有關(guān),提示Tim-3對巨噬細(xì)胞的負(fù)性調(diào)控作用,表明該分子可能是巨噬細(xì)胞新的調(diào)控靶點(diǎn)。在結(jié)構(gòu)上Tim-3胞內(nèi)段較短,不存在像其他負(fù)性免疫調(diào)控分子如PD-1一樣的抑制性基序,因此目前對于該分子發(fā)揮抑制作用的分子機(jī)制尚不十分清楚。探討Tim-3調(diào)控天然免疫細(xì)胞的作用和機(jī)制仍是目前尚不清楚而迫切需要回答的課題。目的:針對上述研究背景及我們的前期研究基礎(chǔ),本論文的研究內(nèi)容及目標(biāo)有以下幾個(gè)方面:1.明確Tim-3對巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控作用;2.進(jìn)一步確證Tim-3是否通過影響巨噬細(xì)胞極化影響疾病的進(jìn)程,并通過干預(yù)實(shí)驗(yàn)評價(jià)將其作為新干預(yù)靶點(diǎn)的可行性;3.重點(diǎn)闡明Tim-3調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的分子機(jī)制,為其應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。方法與結(jié)果:一.體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Tim-3顯著影響巨噬細(xì)胞的極化。為了探討Tim-3對巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控作用,我們以RAW264.7巨噬細(xì)胞系和原代腹腔巨噬細(xì)胞(來源于野生型或Tim-3轉(zhuǎn)基因小鼠)為研究對象,通過Tim-3敲低、過表達(dá)、功能阻斷等實(shí)驗(yàn)手段,結(jié)合ELISA、Real-time PCR等方法,探討了Tim-3對巨噬細(xì)胞炎癥因子表達(dá)和極化的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1)Tim-3信號抑制巨噬細(xì)胞中炎癥因子的表達(dá)。(2)Tim-3信號可以抑制M1型極化,促進(jìn)巨噬細(xì)胞的M2型極化。二.在免疫相關(guān)性疾病,包括膿毒血癥、腸炎及腸腫瘤中,闡明了Tim-3表達(dá)或功能改變、巨噬細(xì)胞極化異常和疾病的發(fā)生發(fā)展三者之間的內(nèi)在聯(lián)系。為了深入探討Tim-3調(diào)控巨噬細(xì)胞極化與疾病的關(guān)系,我們用野生型及Tim-3轉(zhuǎn)基因小鼠建立了與巨噬細(xì)胞極化失衡有關(guān)的三種疾病模型,即膿毒血癥動(dòng)物模型、潰瘍性結(jié)腸炎動(dòng)物模型和腸炎相關(guān)結(jié)直腸癌動(dòng)物模型,并收集了相關(guān)的臨床樣本。主要研究內(nèi)容包括:1)Real-time PCR、FACS等方法分析Tim-3表達(dá)、巨噬細(xì)胞極化和疾病病程之間的關(guān)系;2)通過轉(zhuǎn)基因過表達(dá)或過繼治療等實(shí)驗(yàn)探討體內(nèi)干預(yù)Tim-3通路對巨噬細(xì)胞極化及病程的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果有以下幾個(gè)方面:(1)膿毒血癥中,明確Tim-3通過抑制巨噬細(xì)胞向M1型極化,維持膿毒血癥中巨噬細(xì)胞的極化平衡及體內(nèi)免疫穩(wěn)態(tài),減輕病情進(jìn)展。(2)潰瘍性結(jié)腸炎中,發(fā)現(xiàn)Tim-3表達(dá)降低和巨噬細(xì)胞的M1型極化增強(qiáng)相關(guān);通過Tim-3敲低的巨噬細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移可以加重潰瘍性結(jié)腸炎的病情。(3)結(jié)直腸癌中,發(fā)現(xiàn)Tim-3表達(dá)上調(diào)和巨噬細(xì)胞M2型極化增強(qiáng)相關(guān);在此基礎(chǔ)上Tim-3轉(zhuǎn)基因會(huì)通過加劇巨噬細(xì)胞的極化失衡、進(jìn)一步加重腸癌的病情。三.闡明了Tim-3調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的分子機(jī)制為了探討Tim-3調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的分子機(jī)制,我們基于前期研究基礎(chǔ),以各種細(xì)胞系,包括RAW264.7、CHO、293T、U2OS為主要研究模型,結(jié)合原代巨噬細(xì)胞,利用Tim-3敲低、過表達(dá)以及Tim-3融合蛋白功能阻斷等實(shí)驗(yàn)手段,通過m RNA芯片、mi RNA芯片、Western blot技術(shù)、Real-time PCR、點(diǎn)突變、免疫共沉淀、高內(nèi)涵分析等方法,從以下兩個(gè)層面入手,重點(diǎn)探討了Tim-3對巨噬細(xì)胞極化關(guān)鍵信號通路的影響,發(fā)現(xiàn)了一些全新的調(diào)控機(jī)制:1.發(fā)現(xiàn)Tim-3能通過上調(diào)A20表達(dá)、增強(qiáng)PI3K-AKT活性進(jìn)而抑制LPS/TLR4誘導(dǎo)的NF-κB的活化;同時(shí)發(fā)現(xiàn)Tim-3還可以抑制IRF3的活化和IRF7的表達(dá),參與對IRF3/7的調(diào)控。2.鑒定出Stat1是Tim-3調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的胞內(nèi)關(guān)鍵接頭蛋白,證實(shí)Tim-3能通過抑制Stat1/mi R-155軸,上調(diào)SOCS1的表達(dá),促進(jìn)IL-10、Arg-1的表達(dá),增強(qiáng)巨噬細(xì)胞M2方向的極化。結(jié)論:Tim-3是近年來新近鑒定出的一種免疫調(diào)控蛋白,被醫(yī)學(xué)工作者認(rèn)為是繼CTLA-4、PD-1之后的新一代免疫調(diào)控靶點(diǎn)。很多研究集中在Tim-3對T細(xì)胞的調(diào)控作用。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)在于我們率先證實(shí)了Tim-3對巨噬細(xì)胞,這一關(guān)鍵天然免疫細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)調(diào)控作用,并比較詳細(xì)地闡明了Tim-3調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的分子機(jī)制,為全面認(rèn)識這一分子的調(diào)控功能提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。巨噬細(xì)胞在體內(nèi)廣泛分布,為維持體內(nèi)免疫穩(wěn)態(tài)、維護(hù)機(jī)體健康發(fā)揮關(guān)鍵作用。通過闡明Tim-3在巨噬細(xì)胞極化調(diào)控中的作用及信號通路,為靶向巨噬細(xì)胞的免疫穩(wěn)態(tài)調(diào)控策略提供了新的手段。尤為重要的是,通過闡明Tim-3、巨噬細(xì)胞極化和疾病病程之間的相關(guān)性,進(jìn)一步明確了將Tim-3作為免疫相關(guān)疾病干預(yù)靶點(diǎn)的可行性,為相關(guān)疾病的臨床干預(yù)提供了新的策略及思路。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R392

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本文編號：2729320