【摘要】：研究背景阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,具體病理特征表現(xiàn)為老年斑、神經(jīng)原纖維纏結(jié)及神經(jīng)元數(shù)目減少,其主要臨床特征包括記憶力減退和認(rèn)知功能障礙[1]。目前關(guān)于阿爾茲海默病的發(fā)病機(jī)制尚不清楚,諸多證據(jù)表明,Aβ沉積被認(rèn)為是阿爾茲海默病最重要的致病因素�！癆β蛋白級聯(lián)假說”認(rèn)為,β淀粉樣蛋白(Aβ蛋白)在AD發(fā)生時會異常沉積,引發(fā)包括神經(jīng)元興奮性毒性、神經(jīng)炎癥、tau蛋白高度磷酸化等一系列細(xì)胞級聯(lián)反應(yīng),并作用于神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,最終導(dǎo)致神經(jīng)元功能異�；驍�(shù)量減少,引起一系列精神癥狀[2,3]。目前國內(nèi)外批準(zhǔn)用于AD治療的藥物多為膽堿酯酶抑制劑,代表藥為多奈哌齊,其主要通過抑制乙酰膽堿酯酶活性而抑制乙酰膽堿降解,增加局部乙酰膽堿濃度,從而改善神經(jīng)遞質(zhì)傳遞功能。但多奈哌齊只針對輕、中度AD,隨著病程發(fā)展,功能完整的膽堿能神經(jīng)元數(shù)量減少,多奈哌齊的作用也會隨之減弱。因此,開發(fā)治療AD的新型藥物十分重要。川芎嗪(TMP)來源于中藥川芎的干燥根莖,具有抗炎、抗氧化和抑制細(xì)胞凋亡等多方面藥理作用,但生物利用度不高[4]。J147是近幾年由美國索克生物研究所合成的新型化合物,具有保護(hù)神經(jīng)突觸功能的作用[5]。T-006是我們將TMP分子連接到J147上,經(jīng)過結(jié)構(gòu)修飾而得到的新型化合物,前期體外實驗證明,T-006在應(yīng)激細(xì)胞模型中可表現(xiàn)出顯著的抗氧化應(yīng)激作用,可保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免于損傷[4],提示該化合物有可能成為治療AD的新型藥物。本研究采用東莨菪堿致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙模型和大鼠Aβ1-42側(cè)腦室注射模型,研究了T-006對模型中動物學(xué)習(xí)記憶障礙的改善作用,并對其可能機(jī)制進(jìn)行初步探討。研究目的本研究在東莨菪堿致學(xué)習(xí)記憶障礙小鼠模型和SD大鼠側(cè)腦室注射Aβ1-42模型上,觀察T-006對老年癡呆模型動物學(xué)習(xí)記憶的影響,并探討其可能機(jī)制。實驗方法1.動物飼養(yǎng)雄性SD大鼠40只,SPF級,體重(200±20)g,由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供,許可證號SCXK(粵)2013-0002。動物飼養(yǎng)于SPF級屏障環(huán)境動物室中,自由進(jìn)食飲水。雄性KM小鼠72只,SPF級,體重(20±2)g,由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供,許可證號SCXK(粵)2011-0015。動物飼養(yǎng)于SPF級屏障環(huán)境動物室中,自由進(jìn)食飲水。2.側(cè)腦室注射將大鼠腹腔注射10%水合氯醛(4 ml·kg-1)麻醉,固定于腦立體定位儀上,參照George PaxinosCharles Watson大鼠腦立體定位圖譜確定注射點坐標(biāo),坐標(biāo)為:前囟后0.96 mm,中線旁開2.00 mm,深度4.00 mm。使用5μl微量進(jìn)樣器于注射點勻速緩慢注射5μl Aβ1-42,注射時間5min,完畢后留針10min以保證Aβ1-42充分?jǐn)U散,隨后,緩慢撤針后縫合,碘酒消毒創(chuàng)口。3.Morris水迷宮實驗(Morris water maze)水迷宮裝置由圓形水池和視頻采集系統(tǒng)組成。水池內(nèi)壁黑色,等分為I、II、III、IV4個象限,在IV象限(目標(biāo)象限)中心放置一黑色平臺,藏匿于1cm的水面之下。水迷宮系統(tǒng)自帶恒溫設(shè)備,使實驗時水溫保持在(22±2)℃。水迷宮實驗由兩部分組成:定位航行實驗和空間探索實驗。定位航行實驗持續(xù)四天,每天每只動物訓(xùn)練四次,分別從四個象限的入水點放入水中進(jìn)行訓(xùn)練。實驗時動物入水時同時啟動視頻采集系統(tǒng),限時90s,若動物在90s內(nèi)找到平臺并在其上停留20s以上的,直接取出放回原鼠籠;若動物在90s內(nèi)找到平臺但沒有在其上停留10s或90s內(nèi)未能找到平臺的,將其輕輕引導(dǎo)至平臺并停留20s,再將其放回原鼠籠。正式訓(xùn)練期間記錄每只動物從入水到找到平臺所需時間。定位航行實驗結(jié)束后第二天進(jìn)行空間探索實驗。實驗時撤去平臺,將動物從II象限入水點放入水中,同時啟動視頻采集系統(tǒng),限時90s。評價指標(biāo):(1)動物從入水開始到第一次穿越原平臺位置的時間,即潛伏期;(2)穿越原平臺位置的次數(shù);(3)動物在目標(biāo)象限的游泳路程和時間;(4)每組平均游泳速度,反映動物的體力。4.高架十字迷宮實驗(Elevated plus maze)高架十字迷宮放置于房間的一角,實驗時保持安靜,室溫24℃左右。測試時將每只小鼠頭部正對其中一個開放臂放入迷宮的中央平臺處,同時打開軌跡記錄和分析軟件開始記錄行為學(xué)各項指標(biāo)其自由探究,探究時間限時5 min,觀測人員同時在距離迷宮1.5 m處觀察記錄動物的活動狀況。評價指標(biāo):(1)開放臂活動路程,記錄應(yīng)以小鼠四個爪子均進(jìn)入到臂內(nèi)為準(zhǔn),若有一個爪子退出則為走出該臂;(2)進(jìn)入開放臂時間百分比;(3)進(jìn)入四臂總次數(shù),反映小鼠的體力。5.避暗梭箱實驗(Passive avoidance assay)實驗共進(jìn)行2天,第1天進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練,將小鼠背對著中間隔板的方向放入明室,并開始計時5min并打開電擊裝置使小鼠進(jìn)入暗室便能遭受點擊,讓其自由穿梭明暗室后停留,并記錄其進(jìn)入暗箱的反應(yīng)潛時間和穿梭次數(shù),5 min不進(jìn)入者則剔除;第3天進(jìn)行記憶保持檢測:用同樣方法將動物放入明室,限時5min,但不給予足底電刺激,觀察其第一次進(jìn)入暗箱的反應(yīng)潛伏期和錯誤次數(shù)(進(jìn)入暗箱次數(shù))。6.乙酰膽堿酯酶活性測定(Ach E activity)行為學(xué)實驗結(jié)束后,立即對動物進(jìn)行麻醉,以冰冷生理鹽水灌流后將動物斷頭取腦、分離海馬。將海馬稱重,加入重量9倍的蛋白裂解液,制備腦組織勻漿,隨后以10000×g離心30 min,取上清,放-20℃冰箱保存。根據(jù)Sigma Ach E活性測試盒說明書測定乙酰膽堿酯酶活性,用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量。7.SOD、GSH和MDA活性測定行為學(xué)實驗結(jié)束后,立即對動物進(jìn)行麻醉,以冰冷生理鹽水灌流后將動物斷頭取腦、分離海馬。分別按海馬重量加9倍蛋白裂解液制備腦組織勻漿,10000×g離心30 min,取上清于-20℃冰箱保存。分別根據(jù)南京建成生物工程研究所提供的SOD活性測試盒說明書、GSH含量測試盒說明書和MDA含量測定說明書,測定SOD、GSH及MDA含量,用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量。8.免疫印跡法(western blotting)使用BCA蛋白定量試劑盒對組織勻漿上清液進(jìn)行蛋白定量,將含30μg蛋白的樣品制樣后于90℃水浴5min變性,SDS-PAGE電泳分離后,電轉(zhuǎn)印至PVDF膜上,脫脂奶粉封閉,加入檢測蛋白相應(yīng)一抗,4℃孵育過夜。用TBST洗膜后加入HRP標(biāo)記的二抗,室溫孵育,洗膜后用ECL顯影液顯影,曝光,使用Image J灰度分析軟件進(jìn)行灰度掃描分析,以β-tubulin為內(nèi)參對照,結(jié)果以目的蛋白表達(dá)的灰度值與β-tubulin灰度值比值表示。結(jié)果1、行為學(xué)實驗顯示,T-006可明顯改善動物的學(xué)習(xí)記憶能力,其改善作用與陽性藥物多奈哌齊相當(dāng)。2、乙酰膽堿酯酶活性測定結(jié)果顯示,T-006可降低動物海馬乙酰膽堿酯酶活性,提示T-006可以通過降低乙酰膽堿酯酶活性來改善學(xué)習(xí)記憶能力。3、SOD、GSH和MDA測定結(jié)果顯示,T-006可降低動物海馬MDA含量,升高SOD和GSH含量,改善腦內(nèi)氧化還原狀態(tài),效果優(yōu)于多奈哌齊。4、免疫印跡的結(jié)果顯示,T-006可以升高海馬神經(jīng)突觸蛋白含量;不同程度的降低Aβ1-42誘導(dǎo)的磷酸化tau蛋白過表達(dá),并降低熱休克蛋白含量,而多奈哌齊不能起到類似作用。結(jié)論T-006具有多方面藥理作用,是一種具有前景的多靶點AD治療新藥,具體可以通過:1、加強(qiáng)中樞膽堿能系統(tǒng)活性改善癡呆模型動物學(xué)習(xí)記憶能力;2、抗氧化應(yīng)激作用保護(hù)腦內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞損傷,從而達(dá)到改善癡呆模型動物的學(xué)習(xí)記憶能力;3、可清除腦內(nèi)異常過度磷酸化tau蛋白和增多的熱休克蛋白,從而達(dá)到改善癡呆模型動物的學(xué)習(xí)記憶能力;4、提高腦內(nèi)神經(jīng)突觸蛋白表達(dá)水平,提高突觸可塑性,改善癡呆模型動物的學(xué)習(xí)記憶能力。
【學(xué)位授予單位】：中山大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R965;R-332
【圖文】：

TMP，J147，T-006化學(xué)結(jié)構(gòu)圖

側(cè)腦室注射區(qū)域（藍(lán)色LV區(qū)域即為lateralventricle側(cè)腦室）

本文編號：2728004