【摘要】：沙門氏菌(Salmonella)是一類可引發(fā)家畜、家禽及蛋產(chǎn)品污染,導(dǎo)致食物中毒的常見致病菌。同時(shí),由沙門氏菌引起的感染疾病和抗藥性對(duì)公眾健康已構(gòu)成嚴(yán)重危害。并且,沙門氏菌形成的菌膜在自然界中普遍存在,更加劇了感染疾病的根治難度。然而,常規(guī)的抗生素篩選、開發(fā)速度早已跟不上耐藥菌新增的步伐,為此,盡快發(fā)掘新的高效抗菌藥物在人類對(duì)抗沙門氏菌的這場(chǎng)戰(zhàn)斗中至關(guān)重要。適配體是經(jīng)體外篩選技術(shù),即指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)獲得的與靶標(biāo)特異結(jié)合的寡核苷酸片段。作為小分子治療藥物來(lái)發(fā)揮作用是近年來(lái)適配體的應(yīng)用熱點(diǎn)。隨著SELEX篩選技術(shù)的優(yōu)化改良,更多的適配體被篩選獲得,并證實(shí)具有抗菌效果。這些適配體往往通過(guò)與靶標(biāo)菌體內(nèi)的酶、胞外抗原(如鞭毛或菌毛)等緊密結(jié)合后而分別干擾細(xì)菌的正常代謝、刺激提高機(jī)體免疫反應(yīng)或阻止細(xì)菌入侵生物體,最終發(fā)揮抗菌作用。鑒于適配體控制病原菌致病性的潛能,本課題基于以上研究背景,開展了以下適配體功能分析工作:(1)候選本室由菌體SELEX技術(shù)獲得的多條鼠傷寒沙門氏菌(又typhimurium)特異適配體,分別進(jìn)行序列優(yōu)化。利用在線軟件Mfold對(duì)適配體二級(jí)空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè),在不破壞莖環(huán)主體結(jié)構(gòu)的前提下,選取3條親和力較高的適配體序列進(jìn)行適當(dāng)截短以及堿基修改(STY-1、2、3)。實(shí)驗(yàn)表明,序列優(yōu)化后的STY-1、2、3仍然保留對(duì)S.typhimurium較高的親和力,Kd值均在0～100 nM范圍內(nèi)(Kd值分別為 35.2±4 nM、29.9±4 nM、19.3 ±4 nM),其中,適配體 STY-3對(duì)S.typhimurium的親和力較序列調(diào)整前有較大幅度提升。序列優(yōu)化后的適配體不僅在結(jié)合靶標(biāo)菌時(shí)具有較強(qiáng)的靈敏性,同時(shí)還保留高特異性,能有效區(qū)分靶標(biāo)菌與對(duì)照菌種,可作為小分子探針或功能分子應(yīng)用于后續(xù)靶標(biāo)菌的檢測(cè)與功能機(jī)制研究。(2)以S.typhimurium為靶標(biāo),分別檢測(cè)適配體STY-1、2、3單獨(dú)和組合搭配時(shí)的抑菌效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:單獨(dú)作用時(shí),1μMSTY-3抑制菌落生長(zhǎng)效果最好(抑制率為74.66± 1.28%);三條適配體組合搭配后,STY-2與STY-3聯(lián)合抑制菌落生長(zhǎng)的效果最好(1 μM STY2+3的抑制率為87.84± 1.14%)。競(jìng)爭(zhēng)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,STY-1與STY-2具有競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合菌體表面靶標(biāo)的趨勢(shì),提示二者在結(jié)合菌體時(shí)存在相互干擾或結(jié)合同一靶標(biāo)物質(zhì)的可能性。在控制菌膜形成的實(shí)驗(yàn)中,單獨(dú)作用時(shí),STY-3抑制作用最強(qiáng)(1 μM STY-3實(shí)驗(yàn)組菌膜形成率為50.04±3.71%),組合搭配后STY-2與STY-3聯(lián)合抑制菌膜生長(zhǎng)的效果依然最佳(1μM STY2+3實(shí)驗(yàn)組菌膜形成率僅為35.99±2.26%),且具有抑制特異性;但在解離早期菌膜時(shí),適配體單獨(dú)及組合作用的效率減弱(1.5 μMSTY-3實(shí)驗(yàn)組菌膜形成率為61.31 ±4.26%,1.5μM STY2+3實(shí)驗(yàn)組菌膜形成率為43.50±4.26%),提示菌膜清除難度增加。本研究將適配體的應(yīng)用擴(kuò)展至菌膜治療領(lǐng)域,在降低細(xì)菌耐藥性、對(duì)抗微生物感染方面具有重要的意義。(3)以s.typhimurium為靶標(biāo),分別檢測(cè)適配體STY-1、2、3單獨(dú)及組合搭配時(shí)抑制靶標(biāo)菌黏附豬腸上皮細(xì)胞IPEC-J2的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,這三條適配體同樣能有效降低S.typhimurium.對(duì)IPEC-J2細(xì)胞的黏附效率,且STY-3的黏附抑制效果最佳(2 μM時(shí)黏附抑制率為49.98±1.93%);適配體聯(lián)合作用效果較單獨(dú)作用時(shí)抑制效果增強(qiáng),且組合STY2+3作用最佳(2 μM時(shí)黏附抑制率為67.26±1.64%)。黏附抑制、黏附競(jìng)爭(zhēng)以及黏附置換三組實(shí)驗(yàn)的結(jié)果差異提示,適配體干預(yù)致病菌黏附的效果與適配體加入的濃度和時(shí)間點(diǎn)密切相關(guān)。上述結(jié)果為適配體控制沙門氏菌的致病性提供了新的研究思路。(4)選取本室前期篩選獲得的豬霍亂沙門氏菌(Scholeraesuis 鞭毛特異適配體SC-3,使該適配體與氨芐西林進(jìn)行共價(jià)連接,構(gòu)建為適配體-氨芐西林連接物(SC3-Amp),并探討此連接物對(duì)S.choleraesuis菌膜的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,SC3-Amp連接物有效發(fā)揮了適配體的特異結(jié)合作用和氨芐西林的抑菌作用,在治療菌膜時(shí)其效果明顯強(qiáng)于組分單獨(dú)發(fā)揮作用時(shí),菌膜形成抑制實(shí)驗(yàn)中菌膜形成率僅為28.36±0.57%,早期菌膜解離實(shí)驗(yàn)中菌膜形成率為僅40.00±2.70%。菌膜抑制和解離作用效果的差異提示,菌膜的控制宜在初期采取措施。因此,這種抗生素聯(lián)合靶向性適配體的設(shè)計(jì)思路可擴(kuò)展應(yīng)用于更多的抗生素與適配體,對(duì)未來(lái)開發(fā)新型抗菌膜的功能核酸藥物具有重要意義。
【學(xué)位授予單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R378
【圖文】：

但在菌體結(jié)構(gòu)破壞時(shí)，其細(xì)胞壁中含有的脂多糖會(huì)解離釋放出有一定的侵襲力，構(gòu)成致病性。少數(shù)沙門氏菌如鼠傷寒沙門菌結(jié)構(gòu)和作用與大腸桿菌ＥＴＥＣ的腸毒素相似，能引發(fā)胃腸炎。生菌，可在巨噬細(xì)胞中增殖，并能沿淋巴管、胸導(dǎo)管擴(kuò)散進(jìn)入血癥。隨后，細(xì)菌經(jīng)血液循環(huán)擴(kuò)散至肝臟、脾臟、膽囊、骨髓噻細(xì)胞攝入，又在其胞內(nèi)繼續(xù)增殖，可再次進(jìn)入血液循環(huán)重復(fù)生內(nèi)毒素。逡逑

」Ｍｃｅｌ丨邐｜邋Ｔｉｇｈｔ邋ｊｕｎｃｔｉｏｎ邐ａ—＾邋ＤｅｎｄｎＵｃｃｅｌｌ逡逑圖１－１邐沙門氏菌的感染機(jī)制［１３］邋（１）沙門氏菌黏附小腸上皮；（２）邋（３）沙門氏菌侵入小逡逑腸上皮細(xì)胞和Ｍ細(xì)胞；（４）沙門氏菌被黏膜下層樹突狀細(xì)胞直接攝�。唬ǎ担┘�(xì)菌在細(xì)胞內(nèi)逡逑形成囊泡；（６）沙門氏菌通過(guò)囊泡運(yùn)輸進(jìn)入黏膜下層并被釋放；（７）沙門氏菌被巨噬細(xì)胞逡逑攝取逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ邋ｏｆ邋Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ邋｛＼）Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ邋ｃｅｌｌｓ邋ａｔｔａｃｈ邋ｔｏ邋ｔｈｅ邋ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ邋ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ邋ｂｙ逡逑ｍｅａｎｓ邋ｏｆ邋ａｄｈｅｓｉｎｓ；邋（２）ａｎｄ邋（３）Ｉｎｖａｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ｂａｃｔｅｒｉａ邋ｉｎｔｏ邋ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ邋ｃｅｌｌｓ邋ａｎｄ邋Ｍ邋ｃｅｌｌｓ；邋（４）Ｂａｃｔｅｒｉａｌ逡逑ｃｅｌｌｓ邋ｃａｎ邋ａｌｓｏ邋ｂｅ邋ｄｉｒｅｃｔｌｙ邋ｔａｋｅｎ邋ｕｐ邋ｂｙ邋ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ邋ｃｅｌｌｓ邋ｆｒｏｍ邋ｔｈｅ邋ｓｕｂｍｕｃｏｓａ；邋｛５）Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ邋ｉｓ逡逑ｌｏｃａｌｉｚｅｄ邋ｗｉｔｈｉｎ邋ｔｈｅ邋ＳＣＶ；邋（６）Ｔｈｅ邋ＳＣＶｓ邋ｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｅ邋ｔｏ邋ｔｈｅ邋ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ邋ｍｅｍｂｒａｎｅ邋ａｎｄ邋ｒｅｌｅａｓｅ邋ｔｈｅ逡逑ｉｎｔｅｒｎａｌ邋ｃｅｌｌｓ邋ｔｏ邋ｔｈｅ邋ｓｕｂｍｕｃｏｓａ；邋（７）Ｂａｃｔｅｒｉａ邋ａｒｅ邋ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅｄ邋ｗｉｔｈｉｎ邋ｐｈａｇｏｃｙｔｅｓ逡逑沙門氏菌的侵襲性侵入：目前認(rèn)為，沙門氏菌大部分情況下通過(guò)侵襲在腸黏逡逑膜表面派伊爾氏結(jié)（Ｐｅｙｅｒ’ｓ邋ｐａｔｃｈｅｓ

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本文編號(hào)：2728067