發(fā)布時間：2020-06-23 12:56

【摘要】：目的:研究高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖對小鼠生精微環(huán)境的影響以及白色化脂肪組織與小鼠生精微環(huán)境的信息交流機(jī)制。方法:建立高脂肪飲食誘導(dǎo)的肥胖疾病小鼠模型,利用(hematoxylinand eosin,HE)染色方法檢測飲食誘導(dǎo)的肥胖對小鼠睪丸形態(tài)的影響,利用(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)方法檢測肥胖小鼠睪酮以及(anti-Mullerian hormone,AMH)、(glialcellline-derived neurotrophic factor,GDNF)、(Inhibin,INH)的分泌。利用mRNA測序?qū)ふ曳逝中∈笈c對照小鼠脂肪組織的差異基因。利用定量PCR,ELISA和(immunohistochemistry,IHC)等方法確定差異表達(dá)基因?yàn)橹炯?xì)胞因子。在細(xì)胞水平上,通過定量PCR,WB,ELISA的方法驗(yàn)證脂肪細(xì)胞因子clusterin和resistin對TM3和TM4細(xì)胞分泌功能的影響。利用免疫共沉淀和免疫熒光的方法確定clusterin和resistin的相互作用受體,并利用si-RNA和小分子抑制劑處理TM3和TM4細(xì)胞,證明clusterin和resistin通過其相應(yīng)的受體發(fā)揮功能。在體內(nèi)水平,通過睪丸曲細(xì)精管顯微注射的方法將clusterin和resistin注射到小鼠睪丸內(nèi),檢測其對小鼠睪丸間質(zhì)和支持細(xì)胞功能的影響。結(jié)果:高脂飲食誘導(dǎo)12周后,與正常飲食的對照組相比,肥胖小鼠體重增加,胰島素、血糖、血脂等生化指標(biāo)升高,炎癥因子水平增加。睪丸體積減小,精子數(shù)目降低。HE染色結(jié)果顯示肥胖小鼠睪丸生精小管直徑減小,生精上皮厚度變薄。ELISA結(jié)果顯示肥胖小鼠血清(Gonadotropin-releasing hormone,GnRH)、(luteinizing hormone,LH)、睪酮以及AMH、GDNF、INH的含量降低,雌二醇水平升高。定量PCR和WB結(jié)果顯示合成睪酮的關(guān)鍵基因和轉(zhuǎn)錄因子P450scc(cytochrome p450 cholesterol side chain lyase)、P450c17(cytochrome p450 17α-hydroxylase)、StAR(steroidogenic acute regulatory protein)和 Nur77 的表達(dá)水平降低,Amh、Gdnf、Inha基因的表達(dá)水平也降低。肥胖和正常對照小鼠脂肪組織mRNA測序結(jié)果顯示在肥胖小鼠的附睪白色脂肪組織eWAT(epididymal white adipose tissue)和腹股溝白色脂肪組織 iWAT inguinal white adipose tissue(inguinal white adipose tissue)中 clusterin和resistin的表達(dá)水平顯著降低。通過定量PCR,ELISA的方法檢測結(jié)果可知clusterin和resistin是由脂肪組織分泌的脂因子。分別用兩種脂因子處理TM3和TM4細(xì)胞,定量PCR和WB結(jié)果結(jié)果顯示這兩種脂因子都抑制了 TM3細(xì)胞合成睪酮的基因P450scc、P450c17、StAR和Nur77的表達(dá)和睪酮的分泌。同時,這兩種因子還抑制了 TM4細(xì)胞Amh、Gdnf、Inha基因的表達(dá)以及蛋白的分泌。免疫共沉淀和免疫雙熒光的結(jié)果顯示 VLDLR(very low density lipoprotein receptor)和 TLR4(Toll-like receptor 4)分別是 clusterin 和 resistin 在 TM3、TM4 細(xì)胞中的受體。clusterin 和 resistin睪丸曲細(xì)精管顯微注射結(jié)果顯示,在體內(nèi)條件下,clusterin和resistin的注射導(dǎo)致小鼠睪丸體積變小,HE結(jié)果顯示睪丸曲細(xì)精管生精上皮細(xì)胞嚴(yán)重脫落。同時通過定量 PCR,WB 的結(jié)果顯示睪丸中 P450scc、P450c17、StAR、Nur77 和 Amh、Gdnf、Inha 以及 Jam(junctional adhesion molecule)、Zo-1(Zonula occludens)、Cldn11和Ocln的表達(dá)降低,ELISA結(jié)果顯示睪酮和AMH、GDNF、INH的分泌減少。結(jié)論:高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠睪丸減小,精子數(shù)目降低。高脂誘導(dǎo)的白色化脂肪組織通過分泌的clusterin和resistin抑制小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮的分泌和支持細(xì)胞AMH、GDNF、INH的分泌,從而破壞小鼠睪丸的生精微環(huán)境,導(dǎo)致睪丸和精子數(shù)目減少。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R589.2;R-332
【圖文】：

增殖和存活，而（ｃｏｌｏｎｙ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ邋ｆａｃｏｒ－１，ＣＳＦ－１）特異性地影響體外ＳＳＣｓ自我更新逡逑的過程而不影響原始精原細(xì)胞的增殖。相反，體外暴露于神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白和（ｂｏｎｅ逡逑ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎ４邋，邋ＢＭＰ４）會促進(jìn)了ＳＳＣｓ的分化（如圖２）。然而，最近的逡逑證據(jù)表明支持細(xì)胞在建立小鼠睪丸ＳＳＣｓ微環(huán)境中起主要作用，通過協(xié)調(diào)其他體細(xì)胞逡逑群共同實(shí)現(xiàn)這項(xiàng)功能［５］。逡逑３．邋Ｓｅｒｔｏｌｉ細(xì)胞及分泌的細(xì)胞因子逡逑Ｓｅｒｔｏｌｉ細(xì)胞將生精小管分成基底隔室，該基底隔室主要包括精原細(xì)胞和腔內(nèi)隔逡逑１１逡逑

反應(yīng)影響［２９］；還可作為再生醫(yī)學(xué)的新型細(xì)胞來源。來自中胚層的Ｓｅｒｔｏｌｉ細(xì)胞可以逡逑轉(zhuǎn)化為多功能神經(jīng)干細(xì)胞，這表明支持細(xì)胞在基于細(xì)胞的治療和組織工程中具有很逡逑大的應(yīng)用價值（如圖３所示）。在精子發(fā)生過程中，成體支持細(xì)胞主要通過分泌各逡逑種生長因子和細(xì)胞因子來調(diào)節(jié)ＳＳＣｓ的自我更新，分化和凋亡。睪丸支持細(xì)胞可以逡逑通過旁分泌途徑控制ＳＳＣｓ的去分化過程［３０］。逡逑１２逡逑

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1 姜肋

本文編號：2727364