【摘要】：研究背景:神經(jīng)元是大腦的結(jié)構(gòu)與功能單位之一,是具有不同膜結(jié)構(gòu)域的高度極化細(xì)胞,結(jié)構(gòu)上大致可分為胞體、軸突和樹突,樹突上又發(fā)出許多微小的突起,稱為樹突突起(dendritic protrusion),包括樹突棘(dendritic spine)和絲狀偽足(filopodia)。樹突棘是樹突上發(fā)出的一高度特異化的突起,長度一般不超過5μm,其內(nèi)含有光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、多核糖體、內(nèi)涵體、溶酶體、線粒體等細(xì)胞器。絲狀偽足(filopodia)是樹突上發(fā)出的一具有高度運(yùn)動(dòng)性的細(xì)長突起結(jié)構(gòu),長度一般超過5μm,其內(nèi)富含肌動(dòng)蛋白,無任何明顯的球狀頭部和細(xì)胞器。多項(xiàng)研究認(rèn)為絲狀偽足是樹突棘的前體形式,也有人認(rèn)為絲狀偽足是樹突棘的一特殊類型。樹突棘、軸突末梢的小結(jié)及二者之間的間隙共同形成了突觸,是神經(jīng)元通信的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。突觸可塑性被認(rèn)為是構(gòu)成學(xué)習(xí)和記憶的重要神經(jīng)化學(xué)基礎(chǔ),分為與傳遞效率有關(guān)的功能可塑性和與信息貯存相關(guān)的結(jié)構(gòu)可塑性。樹突棘數(shù)量或形態(tài)的變化參與突觸可塑性的調(diào)節(jié),了解樹突棘或者樹突突起形成的細(xì)胞機(jī)制能夠擴(kuò)展我們對正常和異常腦功能的認(rèn)識(shí)。鈣離子(Ca2+)在調(diào)節(jié)樹突突起的形態(tài)和密度中起著關(guān)鍵作用,是誘導(dǎo)突觸可塑性的基礎(chǔ)。此外,突觸傳遞還需要高水平的ATP,而線粒體通過其提供ATP和調(diào)節(jié)Ca2+穩(wěn)態(tài)的能力在神經(jīng)元發(fā)育和突觸功能中發(fā)揮關(guān)鍵作用。線粒體內(nèi)的鈣穩(wěn)態(tài)是通過 Na+-Ca2+交換通道(mitochondrial sodium calcium exchanger,mNCX)、H+-Ca2+交換通道(mitochondrial hydrogen calcium exchanger,mHCX)、線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)體(mitochondrial calcium uniporter,MCU)復(fù)合物和線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)來實(shí)現(xiàn)的。其中Ca2+通過MCU復(fù)合物進(jìn)入線粒體,通過mNCX、mHCX和mPTP離開線粒體,短暫的mPTP開放可以快速釋放Ca2+。mPTP的分子組成目前尚不明確,最近的多項(xiàng)研究認(rèn)為F1FO-ATP合酶的二聚體,或者單體,或者其c亞基環(huán)參與mPTP的形成,尚無統(tǒng)一結(jié)論。但是親環(huán)蛋白D(Cyclophilin D,CypD)是目前唯一在基因上確定的調(diào)節(jié)mPTP開放的分子。線粒體通透性轉(zhuǎn)換(mitochondrial permeability transition,mPT)是指在特定誘導(dǎo)劑的存在下,mPTP開放,線粒體內(nèi)膜對分子量1,500Da的溶質(zhì)的通透性突然增加,結(jié)果導(dǎo)致線粒體跨膜電位的消失、呼吸鏈解偶聯(lián)、線粒體ATP合成停止和溶質(zhì)的流入,造成線粒體基質(zhì)擴(kuò)張,線粒體腫脹,并引起細(xì)胞色素c釋放和隨后的半胱天冬酶活化,最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此,大家推測抑制mPTP的開放對細(xì)胞有保護(hù)作用。在許多疾病模型(如肌營養(yǎng)不良癥、阿爾茨海默病、心肌梗死)中通過基因敲除或者藥物抑制的方法阻斷CypD的作用,從而干擾mPTP的開放,確實(shí)有保護(hù)作用。但是在心衰模型中,CypD缺失無保護(hù)作用,反而加重心衰。上述兩種情況看起來似乎是相互矛盾的,CypD介導(dǎo)的mPTP開放到底是有害的,還是有有利的?越來越多的研究認(rèn)為,CypD介導(dǎo)的mPTP開放分為長時(shí)程開放和瞬時(shí)開放。mPTP的長時(shí)程開放導(dǎo)致膜電位喪失,氧化磷酸化解偶聯(lián),線粒體基質(zhì)腫脹,ATP消耗和活性氧物質(zhì)增加,最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。而mPTP的瞬時(shí)開放可以導(dǎo)致線粒體膜電位的微小變化,這對細(xì)胞活力沒有任何不利影響,并且可以減少線粒體內(nèi)過量的代謝物和離子(特別是Ca2+),從而避免線粒體腫脹,阻止促凋亡因子的釋放,最終保持線粒體的完整性。因此,mPTP的瞬時(shí)可逆性開放是一有用的生理過程,這也使得大家開始關(guān)注CypD及其介導(dǎo)的mPTP開放的生理作用。研究目的:1.明確CypD介導(dǎo)的mPTP開放對樹突突起形成的影響;2.從CypD介導(dǎo)的mPTP開放對鈣離子及其下游信號(hào)分子影響方面探討其可能的機(jī)制。研究方法:1.原代神經(jīng)元的培養(yǎng):使用出生1天以內(nèi)的Ppif+/+和Ppif-/-小鼠,分離其大腦皮層和海馬,去除腦膜,將神經(jīng)元種植于含Neurobasal A、B27、L-谷氨酰胺和抗生素的培養(yǎng)基中,置于37℃C含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)。培養(yǎng)至14天時(shí)進(jìn)行相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)。2.Dsred慢病毒的包被:用磷酸鈣法轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞,24小時(shí)后收集上清液,過濾,離心,收集的沉淀即為慢病毒顆粒。3.90mM氯化鉀(KC1)處理神經(jīng)元:90mM的KC1溶液在37℃C孵箱中孵育神經(jīng)元3分鐘,棄掉90mM的KCl溶液,使用提前預(yù)熱的神經(jīng)元培養(yǎng)基清洗細(xì)胞1遍,再加入神經(jīng)元培養(yǎng)基,放入37℃C孵箱中孵育10分鐘,這稱為1個(gè)循環(huán)的KC1處理。后再重復(fù)上述步驟,直至完成4個(gè)循環(huán)。4.ATP的測量:使用Abcam ATP分析試劑盒,操作步驟按說明書進(jìn)行。5.mPTP開放的檢測:使用氯化鈷淬滅的鈣黃綠素AM(Calcein AM)染色。6.鈣離子濃度的檢測:使用Fluo-4 AM染色來檢測樹突內(nèi)的鈣離子濃度,使用Rhod-2 AM染色來檢測線粒體內(nèi)的鈣離子濃度。7.蛋白免疫印跡:使用western blotting來檢測控制線粒體融合/分裂以及鈣離子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的相應(yīng)蛋白。8.細(xì)胞免疫熒光染色:用來檢測神經(jīng)元樹突突起的數(shù)目和形態(tài),以及線粒體在樹突突起內(nèi)的分布。9.染色圖像的拍攝、處理和分析:使用尼康熒光倒置顯微鏡和共聚焦顯微鏡進(jìn)行圖像的拍攝,使用顯微鏡自帶的尼康NIS高級(jí)研究軟件進(jìn)行圖像的處理和數(shù)據(jù)分析。10.統(tǒng)計(jì)分析:使用Microsoft Excel(2007)進(jìn)行數(shù)據(jù)的錄入和簡單計(jì)算分析,定量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。使用SPSS(21.0)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的正態(tài)性檢驗(yàn)和統(tǒng)計(jì)分析。兩組間的比較多采用t檢驗(yàn),多組間的比較采用方差分析。P0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究結(jié)果:1.神經(jīng)元去極化引起CypD介導(dǎo)的mPTP瞬時(shí)開放。KCl處理的Ppif+/+神經(jīng)元表現(xiàn)出樹突線粒體Calcein AM染色強(qiáng)度的顯著降低,而CypD敲除的Ppif/-神經(jīng)元染色強(qiáng)度降低不明顯(P0.05)。KC1處理后,兩種類型的神經(jīng)元表現(xiàn)出相似的線粒體長度減少模式,相似的ATP水平變化。2.CypD缺失阻礙了神經(jīng)元去極化誘導(dǎo)的樹突突起的形成。在基線水平時(shí),Ppif+/+和Ppif-/-神經(jīng)元之間的樹突突起、樹突棘和絲狀偽足密度沒有顯著差異。重復(fù)KCl刺激能夠誘導(dǎo)Ppif+/+神經(jīng)元樹突突起密度的顯著增加,其中以絲狀偽足為主,樹突棘變化不明顯;而Ppif-/-神經(jīng)元上述指標(biāo)僅表現(xiàn)出輕度增加(P0.05)。3.CypD缺失損害了神經(jīng)元去極化期間樹突線粒體鈣離子動(dòng)態(tài)的靈活性。在Ppif+/+和Ppif-/-神經(jīng)元中,KC1處理能夠誘導(dǎo)Fluo-4 AM染色強(qiáng)度顯著升高,然后迅速下降至接近基線水平,然而,Ppif-/-神經(jīng)元樹突內(nèi)鈣離子回歸基線水平的速度顯著快于Ppif+/+神經(jīng)元(P0.05)。KC1處理后,Ppif+/+和Ppif-/-神經(jīng)元的Rhod-2 AM染色強(qiáng)度均比其基線水平顯著升高;但Ppif-/-樹突線粒體的升高更為明顯(P0.01)。進(jìn)一步的分析表明,大多數(shù)Ppif+/+樹突線粒體屬于鈣離子“閃爍”型;而大多數(shù)Ppif-/-樹突線粒體在神經(jīng)元去極化期間處于鈣離子“凈增加”狀態(tài)(P0.05)。4.CypD缺失抑制神經(jīng)元去極化狀態(tài)下樹突線粒體的運(yùn)動(dòng)。在基線水平時(shí),Ppif+/+和 Ppif-/-和神經(jīng)元中只有一小部分的樹突線粒體處于運(yùn)動(dòng)狀態(tài),但Ppif+/+樹突線粒體運(yùn)動(dòng)的更活躍(P0.05)。去極化過程中,Ppif-/-樹突線粒體迅速停止運(yùn)動(dòng);而Ppif+/+樹突線粒體在它們達(dá)到穩(wěn)定之前仍在順行和逆行方向上運(yùn)動(dòng)著(P0.05)。并且,不論是在基線水平還是去極化過程中,Ppif+/+比Ppif-/-樹突線粒體在前向和后向運(yùn)動(dòng)上的速度要快(P0.05);去極化過程中,二者的運(yùn)動(dòng)速度皆下降。5.CypD缺失抑制神經(jīng)元去極化狀態(tài)下樹突線粒體的重新分布。在靜息狀態(tài)下,6.32±2.76%的Ppif+/+樹突突起含有線粒體,大約四分之一的Ppif-/-樹突突起含有線粒體成分。在1個(gè)循環(huán)和4個(gè)循環(huán)的KCl誘導(dǎo)的去極化后,Ppif+/+樹突突起含有線粒體的百分比分別顯著升高至16.52±3.39%和23.52±3.82%,而Ppif-/-神經(jīng)元含線粒體的樹突突起的百分比幾乎沒有變化。6.CypD缺失不影響神經(jīng)元去極化過程中控制線粒體融合和分裂的蛋白,但是抑制CaMKII和GluRl的磷酸化。在神經(jīng)元去極化過程中,Ppif+/+和Ppif-/-兩種神經(jīng)元內(nèi)OPA1和MFN2這兩種線粒體融合蛋白及線粒體分裂蛋白DLPl的表達(dá)量沒有發(fā)生顯著變化;而DLP1的磷酸化水平(p-Drpl/DLPl)在去極化的過程豐顯著下降但在這兩種類型神經(jīng)元之間無顯著差異。KCC處理誘導(dǎo)了兩種類型神經(jīng)元中CaMKⅡα和β的活化,但Ppif+/+神經(jīng)元對KC1誘導(dǎo)的CaMKⅡ α和β磷酸化的反應(yīng)更強(qiáng)(P0.05)。在KC1刺激后,Ppif+/+神經(jīng)元中的磷酸化GluRI(p-GluRl)的水平遠(yuǎn)高于Ppif-/-神經(jīng)元中p-GluR1的水平(P0.05),而總GluRl的水平?jīng)]有變化。7.CypD缺失減輕氧化應(yīng)激環(huán)境中樹突線粒體鈣離子擾動(dòng)和樹突突起的損傷。H202處理的Ppif+/+神經(jīng)元樹突線粒體在氯化鉀處理后,其鈣離子水平顯著下降,進(jìn)一步的分析表明其大部分線粒體為鈣離子“凈損失”類型;而大多數(shù)Ppif-/-樹突線粒體仍然具有緩沖鈣離子的能力,盡管它們儲(chǔ)存鈣離子的能力也受損(P0.05)。無論是靜息狀態(tài)下或KCl處理后,H2O2處理的Ppif+/+神經(jīng)元比Ppif-/-神經(jīng)元的樹突突起密度顯著降低(P0.05)。結(jié)論:1.CypD介導(dǎo)的mPTP瞬時(shí)開放能夠促進(jìn)神經(jīng)元去極化誘導(dǎo)的樹突突起形成。2.在氧化應(yīng)激條件下,CypD介導(dǎo)的mPTP長時(shí)間開放能夠抑制神經(jīng)元去極化誘導(dǎo)的樹突突起形成。3.CypD介導(dǎo)的mPTP開放通過對線粒體鈣離子穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié),進(jìn)一步影響線粒體在樹突內(nèi)的運(yùn)動(dòng)和分布,以及CaMKⅡThr286和GluR1 Ser831的磷酸化,最終影響樹突突起的形成。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R338
【圖文】：

圖１去極化引起ＣｙｐＤ介導(dǎo)的ｍＰＴＰ的瞬時(shí)開放。逡逑神經(jīng)元生長至第７天時(shí)，加入Ｄｓｒｅｄ慢病毒。生Ｋ：至第１４天時(shí)，進(jìn)行鈣黃綠素ＡＭ逡逑染色、線粒體長度、體積和ＡＴＰ的測量。加入９０ｍＭ的ＫＣ丨溶液處理yL經(jīng)元３分鐘，逡逑隨后清洗神經(jīng)元丨遍，放入３７°Ｃ孵箱中孵育１０分鐘，這稱為１個(gè)循環(huán)的ＫＣ１處理。逡逑

圖２邋ＣｙｐＤ促進(jìn)神經(jīng)元去極化誘導(dǎo)的樹突突起的形成。逡逑９０ｍＭ的ＫＣ１溶液處理神經(jīng)元３分鐘，隨后清洗神經(jīng)元１遍，放入３７°Ｃ孵箱中孵育逡逑１０分鐘，這稱為１個(gè)循钚的ＫＣ１處理。重復(fù)上述步驟，直至完成４個(gè)循環(huán)。用４％多逡逑

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王東梅;;我們身體里的通信系統(tǒng)[J];小學(xué)時(shí)代;2017年13期

2 胡人義;大腦皮質(zhì)樹突與側(cè)棘間的自身接觸[J];神經(jīng)解剖學(xué)雜志;1997年01期

3 蔣艷芬,錢佩德,蔣文華;國人大腦皮質(zhì)顳平面錐體細(xì)胞基樹突及其棘的形態(tài)學(xué)研究[J];神經(jīng)解剖學(xué)雜志;1991年02期

4 ;有關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)問題解答四則[J];生物學(xué)通報(bào);1987年03期

5 曾理;陳洪鐸;;Thy-1~+樹突狀表皮細(xì)胞的研究進(jìn)展[J];國外醫(yī)學(xué).皮膚病學(xué)分冊;1988年01期

6 鮑t

本文編號(hào)：2727219