【摘要】：目的:間充質(zhì)干細(xì)胞具有高度的自我更新能力、多向分化潛能和免疫調(diào)節(jié)功能。這些優(yōu)勢(shì)使它們成為極具吸引力的研究和臨床應(yīng)用工具。間充質(zhì)干細(xì)胞在治療骨相關(guān)疾病中具有非常重要的意義,此外,間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)在多種因子和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控下,可分化為多種細(xì)胞類型,包括脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞。但其在成骨分化中的具體機(jī)制還不完全清楚。鈣離子電壓門(mén)控?3亞基(Calcium Voltage-Gated Channel Auxiliary Subunit Beta 3,Cacnb3)作為電壓門(mén)控通道的一個(gè)亞基,與鈣離子調(diào)控相關(guān),骨骼的形成離不開(kāi)鈣離子的參與。Cacnb3對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化研究尚未見(jiàn)報(bào)道,因此探討Cacnb3在間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中的作用具有重要意義,本研究主要關(guān)注了Cacnb3如何影響細(xì)胞的成骨分化及其作用機(jī)制。方法:(1)從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中下載去乙�；敢种苿�(HDACi)處理小鼠前體成骨細(xì)胞(MC3T3-E1 preosteoblasts)的生物芯片,利用生物信息技術(shù)分析該生物芯片,與成骨基因數(shù)據(jù)集做合集分析,篩選成骨相關(guān)基因。(2)通過(guò)膠原酶消化法從小鼠脂肪中分離間充質(zhì)干細(xì)胞,進(jìn)行體外培養(yǎng),流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記物。(3)體外培養(yǎng)小鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞ADSCs,成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基為實(shí)驗(yàn)組,正常培養(yǎng)基為對(duì)照組。培養(yǎng)到第14和21天進(jìn)行堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色及茜素紅染色,以檢測(cè)小鼠ADSCs是否具有多向分化潛能和間充質(zhì)干細(xì)胞所具有的干性特征。(4)對(duì)小鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞ADSCs進(jìn)行成骨誘導(dǎo)并進(jìn)行定量分析,檢測(cè)成骨相關(guān)基因和篩選基因的表達(dá)。在小鼠成骨前體細(xì)胞(MC3T3-E1 preosteoblasts)和人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hBMSCs)進(jìn)行相同的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證基因表達(dá)的一致性。并在小鼠成骨前體細(xì)胞中成骨誘導(dǎo)14天進(jìn)行相同的堿性磷酸酶和茜素紅染色分析,以驗(yàn)證成骨誘導(dǎo)是否成功。(5)利用siRNA敲低Cacnb3在MC3T3-E1中的表達(dá),檢測(cè)敲低Cacnb3后對(duì)成骨相關(guān)基因表達(dá)的影響。同時(shí),利用鈣離子熒光探針Fluo-4 AM檢測(cè)敲低Cacnb3對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度水平的影響。結(jié)果:(1)利用生物信息技術(shù)分析表達(dá)譜數(shù)據(jù)篩選出22個(gè)基因,這些基因在成骨分化中表達(dá)上調(diào),在脂肪分化中表達(dá)下調(diào),且受去乙酰化酶抑制劑的嚴(yán)格調(diào)控。通過(guò)功能分析,發(fā)現(xiàn)有6個(gè)基因(Cacnb3、Lpcat2等)與鈣離子調(diào)控相關(guān)。(2)利用酶消化法成功培養(yǎng)出小鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞,傳代穩(wěn)定,增殖能力強(qiáng),利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)證實(shí)有特定的間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物表達(dá)(CD45、CD44、CD29、Sca-1),表明我們所分離培養(yǎng)的小鼠脂肪間充質(zhì)純度較高,可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。(3)小鼠ADSCs成骨誘導(dǎo)14天和21天后,堿性磷酸酶染色和茜素紅染色可看出我們所分離的小鼠ADSCs具有成骨分化潛能和干細(xì)胞特有的干性。(4)小鼠ADSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)后成骨相關(guān)基因(Runx2、Alp、Col1a1、Opn)和篩選出來(lái)的基因Cacnb3和Lpcat2的表達(dá)量在實(shí)驗(yàn)組中明顯高于對(duì)照組(P0.05),進(jìn)一步驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)在MC3T3-E1細(xì)胞系和人的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)中具有相似的結(jié)果。(5)與siRNA-NC組細(xì)胞相比,siCacnb3細(xì)胞中Cacnb3基因的mRNA表達(dá)下調(diào),且mRNA表達(dá)水平在敲低效率70%(P0.001),成骨相關(guān)基因(ALP、Runx2)在沉默第5天后siCacnb3組較siRNA-NC組mRNA表達(dá)均下降。此外,敲低Cacnb3后鈣離子濃度明顯低于siRNA-NC組。結(jié)論:Cacnb3在細(xì)胞的成骨分化過(guò)程中表達(dá)上調(diào),表明Cacnb3基因在細(xì)胞的成骨分化中可能具有促進(jìn)作用,敲低Cacnb3會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平,表明Cacnb3可能是通過(guò)鈣離子通路調(diào)控細(xì)胞的成骨分化,本研究為進(jìn)一步探索間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R329.2
【圖文】：

天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文懷疑是與兒童相關(guān)的骨畸形引起的脆骨[8]。此鞏膜、牙本質(zhì)發(fā)育不全、關(guān)節(jié)過(guò)度活動(dòng)、異常、心血管和中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥等，需要篩查疾病，最重要的是確定每個(gè)年齡組的治療目標(biāo)長(zhǎng)期藥物治療有關(guān)的不良反應(yīng)。目前，臨床上科手術(shù)治療等[11, 12]，但存在治療周期較長(zhǎng)、治。

圖 2.1 小鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（ADSCs）表面標(biāo)志物流式鑒定2.2.2 小鼠 ADSCs 細(xì)胞的多潛能分化的鑒定結(jié)果小鼠 ADSCs 細(xì)胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng) 14 和 21 天后，進(jìn)行茜素紅染色，比較了成骨誘導(dǎo)組和對(duì)照組之間成骨誘導(dǎo)分化特征，對(duì)照組經(jīng)染色后為陰性，細(xì)胞中未見(jiàn)紅色礦化結(jié)節(jié)。成骨誘導(dǎo)組染色后為陽(yáng)性，細(xì)胞間有大量明顯的鈣結(jié)節(jié)現(xiàn)象（圖 2.2A）。ADSCs 成骨誘導(dǎo) 14 天后 ALP 染色均可出現(xiàn)陽(yáng)性，但成骨誘導(dǎo)組顏色明顯比對(duì)照組深（圖 2.2B）。表明本研究中分離提取的 ADSCs 細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)液的作用下，具有良好的成骨分化的能力，也證明了 ADSCs 具有一定的干細(xì)胞干性，結(jié)果符合間充質(zhì)干細(xì)胞的特點(diǎn)。

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本文編號(hào)：2718871