【摘要】：目的肝臟是一個天然免疫占優(yōu)勢的免疫器官,其中包括NKT細(xì)胞、NK細(xì)胞、表達(dá)γδTCR 鏈的γδT 細(xì)胞和粘膜相關(guān)invariant T(mucosal-associated invariant T,MAIT)細(xì)胞。肝臟γδT細(xì)胞比例明顯高于脾臟、淋巴結(jié)和外周血。許多研究表明,γδT細(xì)胞存在胸腺外發(fā)育途徑,小腸是其發(fā)育場所之一,我們實驗室的前期研究也初步證實肝臟有可能是γδT細(xì)胞胸腺外發(fā)育的場所,那么γδT細(xì)胞在肝臟內(nèi)是如何發(fā)育分化的,與其在胸腺中的發(fā)育分化有何不同,尚不清楚。在小鼠個體發(fā)育過程中,胚胎肝臟是造血干細(xì)胞(HSCs)增殖和分化的主要場所,其含有大量的造血干細(xì)胞和造血前體細(xì)胞。出生后,造血位點轉(zhuǎn)移至骨髓,但是有多個研究顯示,小鼠成年后肝臟中依然殘留有少量造血干細(xì)胞并且具有自我更新和長期造血造血重建功能。近年來有研究發(fā)現(xiàn)成年肝臟中存在一群特有的造血干細(xì)胞Lineage-Mac-1+Sca-1+(LMS)細(xì)胞。通過移植轉(zhuǎn)輸實驗發(fā)現(xiàn),其來源于胚胎肝臟造血并且能在肝內(nèi)發(fā)育形成肝臟駐留NK細(xì)胞(LrNKs)。那肝臟特有LMS細(xì)胞能否在肝臟中發(fā)育分化成γδT細(xì)胞?肝臟γδT細(xì)胞是否存在獨特的肝內(nèi)發(fā)育過程?這些問題尚無確切研究。為了探討上述問題,本課題從以下幾個方面對肝臟γδT細(xì)胞肝內(nèi)發(fā)育過程進(jìn)行了初步探究。首先,我們通過檢測肝臟、脾臟、胸腺以及小腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞(IELs)中γδT前體細(xì)胞的比例和表型發(fā)現(xiàn)肝臟γδT前體細(xì)胞比例相對較高,且具有獨特的表型特征。其次,通過體內(nèi)過繼轉(zhuǎn)輸實驗和體外共培養(yǎng)實驗從體內(nèi)體外驗證了肝臟γδT細(xì)胞前體細(xì)胞具有發(fā)育分化為成熟γδT細(xì)胞的能力。最后,我們通過過繼轉(zhuǎn)輸胚胎期、新生期和成年期等不同時期肝臟特有造血干細(xì)胞LMS細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)其均可以在肝臟中重建出γδT細(xì)胞,重建的γδT細(xì)胞具有獨特的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)和Vγ亞型,分泌的細(xì)胞因子以IFN-γ為主。初步揭示了肝臟γδT細(xì)胞獨特的肝內(nèi)發(fā)育過程。方法1.分離成年小鼠肝臟、胸腺、脾臟和小腸單個核細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)檢測其中γδT細(xì)胞和CD24+CD73+γδT細(xì)胞前體細(xì)胞的比例及其表型。2.分選成年小鼠肝臟和胸腺γδT前體細(xì)胞與OP9-DL1共培養(yǎng),體外觀察肝臟或胸腺來源的γδT前體細(xì)胞向成熟γδT細(xì)胞發(fā)育分化的能力。3.分選CD45.1來源的成年小鼠肝臟和胸腺γδT前體細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)輸至半致死量照射(5Gy)的TCRδ-δ+鼠中,體內(nèi)觀察肝臟或胸腺來源的γδT前體細(xì)胞向成熟γδT細(xì)胞發(fā)育分化的能力。4.流式細(xì)胞術(shù)檢測E16.5天小鼠、新生小鼠以及成年小鼠肝臟和胸腺組織中Lin-Mac-1+Sca-1+的表達(dá)情況。5.分選CD45.1背景的E16.5天、新生時期以及成年時期等不同時期肝臟和胸腺Lineage-(Lin-)細(xì)胞或LMS細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)輸至半致死量照射(5Gy)的TCRδ-δ-鼠中,體內(nèi)觀察其向γδT細(xì)胞發(fā)育的情況、細(xì)胞因子分泌的情況以及轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)和Vγ亞型的情況。結(jié)果1.成年小鼠肝臟γδT細(xì)胞和CD24+CD73+γδT細(xì)胞前體細(xì)胞比例顯著高于胸腺和脾臟。并且肝臟γδT細(xì)胞前體細(xì)胞表型特點是高表達(dá)CD44、低表達(dá)CD27;而脾臟和胸腺的CD24+CD73+yδT細(xì)胞前體細(xì)胞高表達(dá)CD27,CD44的表達(dá)為中低水平。2.成年小鼠肝臟CD24+CD73-γδT細(xì)胞前祖細(xì)胞和CD24+CD73++γδT細(xì)胞前體細(xì)胞通過與OP9-DL1細(xì)胞共培養(yǎng)可以分化為成熟的γδT細(xì)胞且具有分泌細(xì)胞因子的能力。肝臟成熟γδT細(xì)胞分泌IL-17水平高于IFN-y,胸腺成熟γδT細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子以IFN-γ為主。3.成年小鼠肝臟CD24+CD73+γδT細(xì)胞前體細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)輸至TCRδ-/-鼠中,可以發(fā)育分化為成熟的yδT細(xì)胞。4.胚胎肝臟來源的單個核細(xì)胞能在各個組織中重建出γδT細(xì)胞,并且重建的γδT細(xì)胞優(yōu)勢分泌細(xì)胞因子IFN-γ;胸腺來源的單個核細(xì)胞重建的yδT細(xì)胞優(yōu)勢分泌細(xì)胞因子IL-17A。5.體內(nèi)轉(zhuǎn)輸實驗結(jié)果表明,新生期和成年期小鼠肝臟來源的Lineage-細(xì)胞均可以在肝臟中重建出γδT細(xì)胞,并且在各組織中重建的γδT細(xì)胞幾乎全部為分泌IFN-y的γδT1細(xì)胞。6.胚胎期、新生期和成年期小鼠肝臟中均有LMS細(xì)胞,并且隨年齡的增長比例逐漸降低,而胸腺在發(fā)育的各個階段均不存在LMS細(xì)胞。7.體內(nèi)轉(zhuǎn)輸實驗結(jié)果表明,胚胎期、新生期和成年期小鼠肝臟來源的LMS細(xì)胞均可以在肝臟中重建出γδT細(xì)胞,并且在各組織中重建的γδT細(xì)胞幾乎全部為分泌IFN-γ的γδT1細(xì)胞,表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子T-bet且主要是Vγ1+γδT細(xì)胞。結(jié)論1.相比于胸腺、脾臟和小腸,肝臟含有較高比例的γδT細(xì)胞前體細(xì)胞,且這些前體細(xì)胞具有獨特的表型和功能特點。2.體外和體內(nèi)實驗驗證了成年小鼠肝臟CD24+CD73-δT細(xì)胞前祖細(xì)胞和CD24+CD73+γδT細(xì)胞前體細(xì)胞均可以發(fā)育分化為成熟的γδT細(xì)胞。3.不同時期肝臟特有LMS細(xì)胞均可以在肝臟中重建出γδT細(xì)胞。重建的γδT細(xì)胞主要是Vγ1+γδT細(xì)胞,分泌的細(xì)胞因子主要是IFN-y,并且T-bet的表達(dá)高于RORγt。肝臟γ5T細(xì)胞存在獨特的肝內(nèi)發(fā)育過程。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R392
【圖文】：

有利的支持。逡逑根據(jù)ＣＤ２７的表達(dá)可以將ＹＳＴ細(xì)胞分為ＣＤ２Ｔ分泌ＩＬ－１７的ＹＳＴ１７細(xì)胞和逡逑ＣＤ２７＋分泌ＩＦＮ－丫的丫５Ｔ１細(xì)胞［３８－４０］（圖３）。通過將其他亞群與幼稚型和記憶逡逑型ＣＤ８＋邋ａｐＴ細(xì)胞進(jìn)行比較，我們發(fā)現(xiàn)ＣＤ２７＋Ｙ５Ｔ細(xì)胞包括幼稚型和記憶型淋巴逡逑細(xì)胞，它們與適應(yīng)性ａＰＴ細(xì)胞具有許多相似的表型和功能特征，而幼稚性Ｙ５Ｔ逡逑細(xì)胞的表型尚需進(jìn)一步的確定［４１］。逡逑１６逡逑

邐山東大學(xué)碩士學(xué)位論文邐逡逑賴于ＴＣＲ信號的強弱。早期的研究表明，強的ＴＣＲ信號將導(dǎo)致ＥＰＫ－ＭＡＰＫ通逡逑路的激活，從而誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子－早期生長反應(yīng)因子（ＥＧＲ１，邋ＥＧＲ３）以及ＤＮＡ結(jié)逡逑合抑制劑３邋（Ｉｄ３）的高表達(dá)，Ｉｄ３是ＥＧＲ的轉(zhuǎn)錄靶點。Ｉｄ蛋白是一種螺旋－環(huán)－逡逑螺旋蛋白Ｅ２Ａ的直接抑制劑，在胸腺細(xì)胞發(fā)育的關(guān)鍵節(jié)點發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，逡逑信號強度假說表明，Ｉｄ３的積累越高，其抑制Ｅ２Ａ的作用越強，從而使胸腺細(xì)胞逡逑向ｙ５Ｔ細(xì)胞譜系分化［５２］。相反地，ＴＣＲ信號越弱，通過Ｎｏｔｃｈ受體和ｐｒｅ－ＴＣＲ逡逑傳遞地信號就越弱，ｌｄ３的積累就越少，因此對Ｅ２Ａ的抑制作用就越弱，從而導(dǎo)逡逑致胸腺細(xì)胞向ａＰＴ譜系分化［５３］。也有研究表明，胸腺細(xì)胞譜系的選擇還取決于逡逑ＴＣＲ與配體結(jié)合的強度，在ＴＣＲ與較弱的配體Ｔ１０相互作用后，胸腺細(xì)胞大多逡逑數(shù)向ａ｜３Ｔ譜系分化，而與較強的配體Ｔ２２結(jié)合后，成熟的ＣＤ２４ｌ°ＣＤ７３ｈｌｙ５Ｔ細(xì)胞逡逑比例更高［５４］。因此，信號強度的差異通過調(diào)節(jié)譜系特異性轉(zhuǎn)錄因子決定了胸腺逡逑細(xì)胞向ａＰＴ和ｙＳＴ譜系的選擇（圖６）。逡逑ａｐ邋Ｔ邋ｃｅｌｌ邋ｌｉｎｅａｇｅ邐ｙ６Ｔ邋ｃｅｌｌ邋ｌｉｎｅａｇｅ逡逑ｌ邐Ｉ邐Ｉ

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本文編號：2717113