【摘要】：胰腺癌惡性程度高,據(jù)預(yù)測(cè)未來(lái)十年,胰腺癌的死亡率逐年上升。胰腺癌易發(fā)生早期轉(zhuǎn)移,多數(shù)胰腺癌病人就診時(shí)已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,其中多轉(zhuǎn)移至腹膜產(chǎn)生腹水、腸梗阻等并發(fā)癥,胰腺癌腹水的產(chǎn)生將增加患者身體負(fù)荷,因此胰腺癌腹水的產(chǎn)生機(jī)制和治療方法成為目前迫切需要解決的難題。惡性腹水(malignant ascites,MA)中含大量免疫因子和免疫細(xì)胞,這些免疫因子和免疫細(xì)胞在惡性腹水的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸過(guò)程中發(fā)揮著極其重要的作用。白細(xì)胞介素9(IL-9)是具有多重作用的免疫效應(yīng)因子,具有促炎和抗炎,或促瘤和抑瘤的雙重作用,是近年的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),與肝硬化腹水相比,肝癌患者腹水中IL-9水平升高,且肝癌患者腹水中的IL-9水平越高,患者生存時(shí)間越短,我們課題組的前期研究還發(fā)現(xiàn)IL-9能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞和胰腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲,使用抗IL-9抗體中和小鼠肝癌腹水中的IL-9能使小鼠生存時(shí)間延長(zhǎng)。雖然在人肝癌腹水和小鼠肝癌腹水中IL-9水平升高,但是IL-9在胰腺癌腹水中的水平尚未可知,因此,為了能夠了解IL-9與胰腺癌腹水的關(guān)系以及進(jìn)一步闡明胰腺癌腹水的發(fā)病機(jī)制、發(fā)生發(fā)展和預(yù)后轉(zhuǎn)歸,建立一種適宜的胰腺癌腹水小鼠動(dòng)物模型是非常有必要的。胰腺癌腹水中的IL-9水平怎樣?IL-9是否可以作為胰腺癌腹水的免疫干預(yù)治療靶點(diǎn)呢?為探索上述問(wèn)題,我們將通過(guò)建立胰腺癌腹水小鼠動(dòng)物模型并檢測(cè)模型小鼠外周血和腹水中的IL-9水平,以及干預(yù)小鼠動(dòng)物模型兩方面進(jìn)行研究。第一部分胰腺癌腹水小鼠動(dòng)物模型的建立目的:胰腺癌惡性程度高,易侵襲轉(zhuǎn)移至腹腔產(chǎn)生腹水,嚴(yán)重影響病人的生活質(zhì)量及生存時(shí)間,因此建立一種合適的胰腺癌腹水小鼠動(dòng)物模型顯得尤為重要,可以為闡明胰腺癌腹水的發(fā)病機(jī)制、診斷及治療提供合適的工具。方法:采用Panc02細(xì)胞系(G0)腹腔注射C57BL/6小鼠出現(xiàn)腹水,第一批注射Panc02細(xì)胞系的小鼠命名為g1。然后從g1中抽取腹水并重新注入新的小鼠腹腔,命名為g2,這樣一直循環(huán)直到g10。比較g1,g5和g10小鼠中出現(xiàn)腹水的比例、腹水量和小鼠的生存時(shí)間。將g1,g5和g10小鼠腹水中的胰腺癌細(xì)胞進(jìn)行分離提純并體外培養(yǎng),分別命名為G1,G5和G10。將G0、G1、G5、G10細(xì)胞分別按5×10~5,1×10~6,2×10~6和5×10~6的細(xì)胞量分四組(每組5只)注射新的小鼠,以篩選出用于建立動(dòng)物模型的最佳細(xì)胞量。通過(guò)蘇木精-伊紅(HE)染色和透射電子顯微鏡(TEM)檢測(cè)比較G0,G1,G5和G10胰腺癌細(xì)胞之間的形態(tài)學(xué)變化。通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室實(shí)驗(yàn)比較G0,G1,G5和G10胰腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。ELISA法測(cè)定正常對(duì)照小鼠血漿中的IL-9水平,以及g1,g5和g10胰腺癌腹水小鼠血漿和腹水中的IL-9水平。結(jié)果:腹水經(jīng)過(guò)小鼠間傳代,模型小鼠出現(xiàn)腹水的比例、腹水量逐漸增加,生存時(shí)間逐漸減少,至g5小鼠時(shí)逐漸穩(wěn)定;經(jīng)過(guò)篩選,1×10~6個(gè)G1胰腺癌細(xì)胞為最佳建立模型細(xì)胞量。細(xì)胞形態(tài)學(xué)表現(xiàn)及劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與G0胰腺癌細(xì)胞相比,G1、G5、G10胰腺癌細(xì)胞遷移、侵襲能力逐漸增強(qiáng)。ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示腹水模型小鼠血漿中IL-9水平較正常對(duì)照小鼠升高,模型小鼠腹水中的IL-9水平隨著傳代次數(shù)的增加逐漸升高,且IL-9升高水平與小鼠生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論:1×10~6個(gè)G1胰腺癌細(xì)胞小鼠腹腔注射為最佳的胰腺癌腹水小鼠動(dòng)物模型建立方法。IL-9可能對(duì)胰腺癌腹水的發(fā)生發(fā)展起促進(jìn)作用。第二部分抗IL-9抗體對(duì)小鼠胰腺癌腹水的作用研究目的:測(cè)定胰腺癌腹水模型小鼠腹水中的IL-9、VEGF和MMP-2水平,探索抗IL-9抗體治療小鼠胰腺癌腹水的作用及其機(jī)制,闡明IL-9在胰腺癌腹水中的作用。方法:應(yīng)用第一部分實(shí)驗(yàn)中G1胰腺癌細(xì)胞建立胰腺癌腹水小鼠動(dòng)物模型,建立模型24小時(shí)后將15只小鼠隨機(jī)分為10μg組,20μg組,30μg組,每組5只,分別給予10μg,20μg和30μg抗IL-9抗體腹腔注射,隔天給藥1次,共5次,末次給藥結(jié)束24小時(shí)后處死小鼠,檢測(cè)各組小鼠腹水中的IL-9濃度,篩選出最佳抗IL-9抗體干預(yù)濃度。同樣方法繼續(xù)造模45只小鼠,隨機(jī)分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組,每組15只。實(shí)驗(yàn)組小鼠給予腹腔注射20μg抗IL-9抗體,陰性對(duì)照組小鼠給予腹腔注射20μg同型對(duì)照IgG抗體,空白對(duì)照組小鼠給予腹腔注射等體積生理鹽水,每只小鼠注射藥物體積均為0.2ml,隔天給藥1次,共給藥5次。末次給藥結(jié)束24小時(shí)后,每組隨機(jī)處死10只小鼠,采集小鼠腹水,測(cè)量腹水體積,收集腹水上清,采用ELISA法檢測(cè)腹水中的IL-9、VEGF?MMP-2水平,剩余小鼠觀察生存時(shí)間。結(jié)果:干預(yù)后空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠的腹水體積分別為(2.87±0.20)ml、(2.88±0.25)ml、(2.17±0.35)ml,與空白對(duì)照組以及陰性對(duì)照組相比較,實(shí)驗(yàn)組小鼠的腹水體積明顯減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)�？瞻讓�(duì)照組、陰性對(duì)照組以及實(shí)驗(yàn)組小鼠的平均生存時(shí)間分別為(13±2)天、(12.8±1.79)天、(15.6±1.14)天。實(shí)驗(yàn)組小鼠的生存時(shí)間顯著長(zhǎng)于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。比較各組小鼠腹水中的IL-9、VEGF和MMP-2表達(dá)水平,研究結(jié)果顯示:與空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組相比較,實(shí)驗(yàn)組小鼠腹水中的IL-9水平明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組相比較,實(shí)驗(yàn)組小鼠腹水中的VEGF水平明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);但三組小鼠腹水中的MMP-2水平相比較無(wú)明顯變化,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:抗IL-9抗體可以有效抑制小鼠胰腺癌腹水的產(chǎn)生,延長(zhǎng)小鼠的生存時(shí)間�？笽L-9抗體抑制小鼠胰腺癌腹水的機(jī)制可能是通過(guò)抑制腹水中VEGF的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R735.9;R-332
【圖文】：

本研究項(xiàng)目?jī)?nèi)容的實(shí)驗(yàn)路線圖

傳代至第五代小鼠后，小鼠出現(xiàn)腹水的比例、腹水量和小鼠的生存時(shí)漸穩(wěn)定。g5 和 g10 小鼠出現(xiàn)腹水的比例和腹水量比 g1 小鼠更高（圖 g1 小鼠生存時(shí)間比 g5 和 g10 小鼠生存時(shí)間更長(zhǎng)（圖 3B）,差異有統(tǒng)計(jì)義（P<0.05）。而 g5 和 g10 小鼠相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）

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9 輔桓欽;姚偉;陸n

本文編號(hào)：2716122