發(fā)布時(shí)間：2020-06-16 15:14

【摘要】：目的:肺炎鏈球菌磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)是糖酵解途徑中發(fā)揮關(guān)鍵作用的酶。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)GAPDH不僅存在于細(xì)菌的胞內(nèi)也可以定位于細(xì)菌的表面,并且參與了其它的生理過(guò)程,如細(xì)胞凋亡、DNA修復(fù)及自噬。已有研究報(bào)道GAPDH在多種細(xì)菌中與細(xì)菌毒力密切相關(guān),并且推測(cè)其可作為一個(gè)潛在的疫苗靶點(diǎn)。因此,本研究擬探索皮下免疫肺炎鏈球菌GAPDH對(duì)小鼠抵抗肺炎鏈球菌感染的保護(hù)效果,并進(jìn)一步探索發(fā)揮免疫保護(hù)作用的機(jī)制,為肺炎鏈球菌蛋白疫苗的臨床前研究提供依據(jù)。方法:利用原核表達(dá)重組技術(shù)制備重組GAPDH(rGAPDH)蛋白,采用鎳柱純化后去除內(nèi)毒素(LPS),并通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)排除殘留的LPS的干擾。實(shí)驗(yàn)組小鼠經(jīng)皮下免疫rGAPDH及鋁佐劑共四次,每次間隔兩周,末次免疫后七天構(gòu)建肺炎鏈球菌敗血癥模型和定植模型,通過(guò)測(cè)定生存率及鼻腔灌洗液和肺勻漿中的細(xì)菌載量來(lái)評(píng)價(jià)rGAPDH的保護(hù)效果。在體外實(shí)驗(yàn)部分,用rGAPDH處理骨髓來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞(BMDCs)研究GAPDH發(fā)揮免疫保護(hù)作用相關(guān)的受體及信號(hào)通路。利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)抗原特異性抗體效價(jià)、抗體亞型以及細(xì)胞因子的表達(dá)。利用蘇木精-伊紅(HE)染色分析肺組織切片炎性改變。采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)分析BMDCs表面的共刺激分子以及細(xì)胞凋亡情況。用小分子抑制劑和Western blot分析rGAPDH激活BMDCs相關(guān)的信號(hào)通路。結(jié)果:成功制備GAPDH重組蛋白,經(jīng)SDS-PAGE分析,純度在90%以上。用鱟試劑檢測(cè)殘留LPS濃度顯示低于0.1EU/ml,達(dá)到體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)要求。并且在體外的LPS排除實(shí)驗(yàn)中證實(shí)重組蛋白中殘留的LPS不會(huì)影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)用rGAPDH皮下免疫小鼠后,小鼠可以產(chǎn)生較高的抗原特異性抗體。在敗血癥模型中,實(shí)驗(yàn)組小鼠的生存率高于PBS對(duì)照組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;在定植模型中,實(shí)驗(yàn)組小鼠鼻腔灌洗液和肺勻漿中的細(xì)菌載量均顯著低于PBS對(duì)照組。在體外試驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)rGAPDH可以引起B(yǎng)MDCs表面共刺激分子CD40、CD86和MHC II的高表達(dá)以及細(xì)胞因子IL-12p70、IL-6和TNF-α的釋放增加,提示rGAPDH能夠誘導(dǎo)BMDCs表型和功能的成熟。然而,用rGAPDH處理Toll樣受體2(TLR2)和Toll樣受體4(TLR4)缺陷鼠的BMDCs后,表面共刺激分子的表達(dá)和細(xì)胞因子水平與野生(WT)組相比顯著地降低,提示rGAPDH可能通過(guò)TLR2和TLR4發(fā)揮作用。后續(xù)的研究表明rGAPDH可以激活MAPKs、PI3K-Akt和NF-κB的磷酸化,同時(shí)也可以上調(diào)mir-146a和下調(diào)mir-27a的表達(dá)。結(jié)論:1)肺炎鏈球菌GAPDH可以作為疫苗的候選蛋白;2)rGAPDH能夠通過(guò)TLR2和TLR4激活BMDCs發(fā)揮免疫保護(hù)效應(yīng)。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R378
【圖文】：

15圖 1-1 肺炎鏈球菌不同菌株之間 GAPDH 氨基酸序列比較Fig 1-1 Multiple amino acid sequence alignment of GAPDH encoded by different kinds ofStreptococcus pneumoniae

圖 1-1 肺炎鏈球菌與小鼠和人的 GAPDH 氨基酸序列比較Fig 1-1 Multiple amino acid sequence alignment of GAPDH encoded by Streptococcuspneumoniae, mouse and huamn3.2 重組蛋白的制備3.2.1 重組蛋白 GAPDH 的表達(dá)及純化在大腸桿菌中表達(dá) rGAPDH，使用 Ni2 +電荷柱層析純化，然后用 10％SDS-PAGE 分析。G-250 染色后，在分子量為 37KDa 處可見(jiàn)明顯條帶，并且其純度高于 95％（圖 2-1）。

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2 李潔;謝文光;沈倍奮;邵寧生;;GAPDH功能多樣性研究進(jìn)展[J];軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊;2006年05期

3 任廣睦;王英元;劉季;;大鼠死后腦組織GAPDH mRNA多位點(diǎn)降解與晚期死亡時(shí)間的關(guān)系研究[J];四川大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2009年05期

4 尚海旭;井然;賈弘y

本文編號(hào)：2716200