【摘要】：黑腹果蠅作為研究先天免疫機制的模式生物,在免疫學史上起到了里程碑式的重要作用。對于果蠅的先天性免疫研究科學家們已大致掌握了它的機理,果蠅的先天免疫包括體液免疫、細胞免疫以及黑化反應三方面,其中Toll免疫信號通路和Imd免疫信號通路是果蠅最重要的體液免疫方式。而Toll通路是果蠅中被廣泛了解的重要通路之一。其作用機制是主要通過一系列信號傳導、級聯(lián)反應抵抗革蘭氏陽性菌以及病原體的入侵。已有大量研究表明,microRNA(miRNA)在果蠅免疫信號傳遞過程中發(fā)揮著重要的調控作用。miRNA是一類廣泛存在于真核生物中的小非編碼RNA,長度約為20個核苷酸,通過結合靶基因mRNA的特定靶位點發(fā)揮其調控轉錄后水平的基因表達的作用,進而調控生物體的各種生理活動。然而目前,雖然有關Toll信號通路的機制的研究報道已經十分透徹了,但對于果蠅Toll信號通路相關miRNA的研究卻不夠清晰。故本論文采用實驗生物學和生物信息學有機結合的方法,針對miRNA能否調控果蠅Toll信號通路設計如下相關實驗。通過體內、體外實驗證明果蠅miR-959能夠直接靶向tube基因來調控Toll信號通路。本論文所取得的主要實驗研究結果如下;1.利用Tub-Gal80ts/+;Tub-Gal4系統(tǒng)果蠅與UAS-miR-959/960/961/962果蠅雜交,得到miR-959/960/961/962高表達的果蠅株,通過實時熒光定量(qRT-PCR)檢測高表達果蠅在感染革蘭氏陽性菌藤黃微球菌(M.luteus)后(0h、6h、12h、24h、48h和72h)抗菌肽的表達量,確認其免疫相關性。隨后又檢測分別高表達miR-959、miR-960、miR-961、miR-962果蠅在RNA水平抗菌肽Drs的表達量。結果顯示miR-959在12h時Drs的表達量顯著下降。并且對miR-959/960/961/962這一簇果蠅中的每個miRNA分別在其高表達果蠅中檢測miRNA的表達量,再通過Western Blotting實驗進一步驗證,確定miR-959具有免疫相關性。2.采用革蘭氏陽性菌刺激野生型果蠅,在RNA水平分時間點(0h、3h、6h、12h、24h、48h)檢測果蠅體內的miR-959表達量,在6個時間點表達量都上調并在12h時miR-959的表達量顯著升高,達到峰值,這表明miR-959被陽性菌刺激后在野生型果蠅中可能具有Toll信號通路的免疫相關性。3.為進一步研究miR-959影響果蠅Toll通路的作用機制,我們通過TargetScan和miRanda兩種生物信息學預測軟件預測了miR-959可能靶向的基因是tube。4.采用雙熒光素酶報告系統(tǒng)在果蠅S2細胞內驗證miR-959與靶基因tube的相互關系,直接證明tube是miR-959的靶基因。5.在果蠅體內利用qRT-PCR再次驗證了miR-959和tube基因的靶標關系,進一步證實miR-959通過靶向tube抑制抗菌肽的表達。6.構建高表達miR-959與miR-959sponge雜交為一體的補償型果蠅果蠅,再進一步地確定了miR-959在果蠅體內對Toll通路負調控作用。綜上所述,我們通過對miR-959/960/961/962這一簇miRNA的免疫相關性的確定,發(fā)現(xiàn)這簇miRNA中只有miR-959可能負調控果蠅Toll免疫信號通路,并進一步探究了miR-959發(fā)揮這一功能的內在機制。最終發(fā)現(xiàn)miR-959通過結合靶基因tube的3’UTR,影響其正常表達,從而減少抗菌肽Drs的表達實現(xiàn)對Toll信號通路的負調控。本課題為探究miRNA在先天免疫中的功能資料庫補充了相關研究參考。
【學位授予單位】：南京師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R392
【圖文】：

圖 1.1 miRNA 合成的機制[62]Figure 1.1 structure and biogenesis1.1.3 miRNA 的作用機制miRNA 在生物復雜性的進化中起著重要作用[16]，是轉錄后水平上基因表達的關鍵調控因子[15]。在了解 miRNA 生物學方面的進展以及越來越多的不同測序基因組的可用性之后，逐漸揭示了 miRNA 及其靶點的分子機制[17]。首先成熟的 miRNA 與相關蛋白形成 RISC 沉默復合體，通過識別特定的序列結合到靶基因的 3’UTR 的相關區(qū)域上，進而發(fā)揮其調控作用，通過抑制靶基因的轉錄后水平過程來抑制其表達。miRNA 與靶基因的結合作用分為完全堿基互補配對原則和不完全堿基互補配對原則，通過結合特定靶基因 3'UTR 的特殊區(qū)域，發(fā)揮抑制mRNA 轉錄后過程或直接降解 mRNA 的作用[18]。在一般情況下，在動物體內 miRNA與靶基因的靶位點兩者通過不完全互補配對方式結合，對基因的翻譯過程造成阻斷，從而抑制基因表達[19]。另一種方式多數(shù)存在在植物體內，當 miRNA 與靶 RNA 完全互補配對時，引起目的 mRNA 的特異性斷裂,從而導致基因沉默。miRNA 和目的基因

3圖 1.2 miRNA 的作用機制Figure 1.2 Mechanism of action of miRNAiRNA 的功能編碼小 RNA 在多種生物體內的基因表達調控中發(fā)揮著重要作用[24]。桿線蟲中就被報道的 miRNA 用于調節(jié)發(fā)育時起，在各種各樣的生物千種新的 miRNA，這些 miRNA 可能在每個生物或多數(shù)生理過程中。動物來說，miRNA 可以調節(jié)細胞分化、發(fā)育和凋亡，據已有研究表明參與調控動物生殖細胞的增殖與分化；miR-14 通過抑制凋亡蛋白的凋亡，對于胚胎的形成與發(fā)育有重要的生物學意義。此外，miRNA 調節(jié)作用，例如 miR-218 在海馬發(fā)育過程中介導的興奮傳遞調控和態(tài)調控中發(fā)揮關鍵作用。同樣 miRNA 也參與植物體器官發(fā)育和環(huán)境

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本文編號：2714614