【摘要】：世界范圍內(nèi),宮頸癌為女性第四位高發(fā)惡性腫瘤。高危型人乳頭瘤病毒(HPV)持續(xù)感染是宮頸癌的主要致病因素。HPV結(jié)構(gòu)基因編碼主要衣殼蛋白(L1)和次要衣殼蛋白(L2),兩者共同形成病毒的二十面體衣殼。外源表達(dá)的L1蛋白可以在體外自組裝成病毒樣顆粒(VLPs),其超微結(jié)構(gòu)和免疫原性與天然病毒類似,目前已上市或在研的HPV預(yù)防性疫苗均以上述HPVL1 VLPs為基礎(chǔ)。HPV預(yù)防性疫苗至少含有兩個(gè)型別的L1抗原,甚至更多型別的L1抗原,所有HPV疫苗均含有HPV 16 L1抗原。本課題對(duì)多價(jià)疫苗中HPV16 L1抗原的定量及免疫原性特點(diǎn)進(jìn)行了深入研究,并得到以下結(jié)果。1.HPV16 L1抗原ELISA定量方法的建立與應(yīng)用目前已有三種HPV預(yù)防性疫苗在我國(guó)上市,國(guó)內(nèi)還有9家企業(yè)15個(gè)品種的HPV預(yù)防性疫苗處于不同的研究階段�，F(xiàn)階段各生產(chǎn)企業(yè)利用各自的HPV16型特異性單抗建立雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)以檢測(cè)各自的HPV16 L1抗原,使抗原檢測(cè)結(jié)果差異大。因此急需篩選一株具有代表性的HPV16型特異性單抗以建立統(tǒng)一的ELISA抗原檢測(cè)方法。比較分析13株具有中和活性的HPV16單抗,HPV16.001的中和活性最強(qiáng),IC50為0.6ng/mL。從中和活性最強(qiáng)(IC5010ng/mL)的6株單抗中選擇4個(gè)代表株進(jìn)行結(jié)合特性分析,HPV16.001結(jié)合親和力最高(EC50:2.6ng/mL)且結(jié)合最穩(wěn)定,不受抗原表達(dá)系統(tǒng)的影響。競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)表明HPV16.001識(shí)別HPV16 VLPs上主要的中和表位而且能夠代表免疫后血清中大部分中和抗體。以中和活性高、結(jié)合特性好而且具有表位優(yōu)勢(shì)的HPV16.001為基礎(chǔ),建立了統(tǒng)一的ELISA抗原檢測(cè)方法。通過(guò)對(duì)線性、特異性和精密度等方法學(xué)參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證,表明本研究建立的雙抗體夾心ELISA方法適用于HPV16 L1抗原的定量檢測(cè),可用于HPV16 L1抗原鑒別和相對(duì)效價(jià)測(cè)定。2.HPV多價(jià)聯(lián)合疫苗中16型和18型L1抗原質(zhì)譜定量方法的建立與應(yīng)用目前HPV預(yù)防性疫苗均是以HPV VLPs為基礎(chǔ)的多價(jià)聯(lián)合疫苗,從2價(jià)聯(lián)合到14價(jià)聯(lián)合。傳統(tǒng)的蛋白定量方法,例如BCA法,無(wú)法區(qū)分定量每一型別HPVL1抗原。雙抗體夾心ELISA法雖然可以區(qū)分定量各型別L1抗原,但篩選出針對(duì)10余種型別中每一型別L1抗原的特異性單抗耗時(shí)耗力,且ELISA法的定量易受疫苗中佐劑的影響。因此急需建立質(zhì)譜檢測(cè)方法,解決HPV多價(jià)聯(lián)合疫苗中各型別L1抗原同時(shí)定量的問(wèn)題。本研究基于穩(wěn)定同位素標(biāo)記的質(zhì)譜定量的分析思路,在肽段基本篩選指標(biāo)基礎(chǔ)上,增加肽段特異性和質(zhì)譜特性指標(biāo),確定HPV16L1和HPV18L1蛋白的定量特征肽段分別是AGAVGENVPDDLYIK和FSLDLDQYPLGR。使用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的定量特征肽段作內(nèi)標(biāo),建立了 HPV多價(jià)聯(lián)合疫苗中HPV16 L1和HPV18 L1蛋白的質(zhì)譜檢測(cè)方法。HPV單價(jià)樣品和多價(jià)聯(lián)合疫苗經(jīng)0.1%RSF變性和胰蛋白酶酶解后,進(jìn)行質(zhì)譜測(cè)定,采用穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)法定量。結(jié)果表明,HPV16 L1和HPV18L1蛋白在20-500nM范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)R2分別是0.998和0.995。方法的最低檢測(cè)限分別為1.0nM和0.5nM,最低定量限分別為2.8nM和1.7nM,日內(nèi)回收率分別為83.96%～113.57%和81.40%～100.43%,日間回收率分別為86.00%～100.20%和87.10%～103.49%,日內(nèi)精密度分別為1.12%～4.65%和0.79%～5.91%,日間精密度分別為5.09%～10.59%和4.17%～11.05%。該質(zhì)譜法測(cè)定的Gardasi1中HPV16 L1和HPV18 L1蛋白的含量分別是46.9±0.8g和17.2±0.28g,Gardasil9中分別是51.2±2.0μg和33.2±0.6μg,均與標(biāo)示量相近。本研究建立的質(zhì)譜定量方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、靈敏,可同時(shí)定量HPV多價(jià)聯(lián)合疫苗中的HPV16L1和HPV18L1蛋白。3.HPV16 L1抗原的免疫保護(hù)活性涵蓋L1突變株的研究隨著HPV16病毒的進(jìn)化,HPV16型內(nèi)變異株越來(lái)越多。對(duì)截止至2016年底的所有1204個(gè)HPV16型內(nèi)變異株L1蛋白的序列進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)505個(gè)氨基酸中,270個(gè)位點(diǎn)發(fā)生變異,變異率為0.08%～20.18%。為分析HPV16預(yù)防性疫苗株對(duì)這些自然點(diǎn)突變株的保護(hù)效果,利用定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建39個(gè)點(diǎn)突變株,包括自然狀態(tài)下的高頻突變位點(diǎn)和表位相關(guān)突變位點(diǎn)。利用真核蛋白表達(dá)系統(tǒng),成功包裝31株高滴度HPV16突變假病毒。利用假病毒為基礎(chǔ)的中和實(shí)驗(yàn)(PBNA)分析31株突變假病毒對(duì)單抗和免疫血清的中和敏感性變化。結(jié)果表明,21株突變假病毒對(duì)某些單抗的中和敏感性發(fā)生變化,其中20株突變假病毒對(duì)某些單抗的中和敏感性下降,8株突變假病毒對(duì)某些單抗的中和敏感性上升,6株突變假病毒對(duì)某些單抗徹底失去了反應(yīng)性。免疫血清雖然可中和上述31株單點(diǎn)突變假病毒,但C428W和K430Q兩株突變假病毒對(duì)免疫血清的中和敏感性分別下降9倍和11倍。本部分結(jié)果表明,截至目前,HPV16預(yù)防性疫苗株尚能夠誘導(dǎo)高效廣譜的保護(hù)性免疫,但HPV16L1的抗原性正在發(fā)生變化,需要密切監(jiān)測(cè)。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R392
【圖文】：

高危型ＨＰＶ持續(xù)感染是宮頸癌的主要致病因素。世界范圍內(nèi)，宮頸癌為女性逡逑第四位高發(fā)惡性腫瘤，構(gòu)成全球女性健康重大挑戰(zhàn)。２０１８年宮頸癌新增病例約５７逡逑萬(wàn)，死亡病例約３１萬(wàn)［１６］。約９０％的宮頸癌死亡病例發(fā)生在中低收入國(guó)家（圖１．２［１７＾），逡逑其死亡率是發(fā)達(dá)國(guó)家的１８倍［１８］。宮頸癌的高危因素包括易感染ＨＰＶ行為、使ＨＰＶ逡逑免疫應(yīng)答受損行為或兩者兼具的行為［１９，２（）］。具體包括：性伴侶多、過(guò)早性生活、免逡逑疫抑制、性傳播疾病導(dǎo)致的宮頸炎癥對(duì)宮頸的長(zhǎng)期刺激、ＨＰＶ相關(guān)的外陰或陰道疾逡逑病史、無(wú)宮頸篩查等［２１，２２］。宮頸癌的發(fā)病主要與ＨＰＶ感染引起機(jī)體內(nèi)源性因素產(chǎn)逡逑生影響，如相關(guān)癌基因激活、抑癌基因失活、端粒酶活性高表達(dá)和機(jī)體免疫調(diào)節(jié)機(jī)逡逑制失衡等一系列病理改變，引起細(xì)胞增殖與凋亡調(diào)節(jié)異常，導(dǎo)致組織癌變［２３］。具體逡逑的發(fā)病機(jī)制如圖１．３『２４，２５］所示。宮頸篩查和接種ＨＰＶ預(yù)防性疫苗是預(yù)防宮頸癌的最逡逑有效措施［２４］。逡逑９逡逑

ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ，ＴＳＱ）串聯(lián)質(zhì)譜儀，，也可以在四極桿－飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ－ｔｉｍｅ逡逑ｏｆｆｌｉｇｈｔ，Ｑ－ＴＯＦ）或線性離子講（Ｌｉｎｅａｒｉｏｎｔｒａｐ）質(zhì)譜儀上進(jìn)行。基于三重四級(jí)桿逡逑質(zhì)譜儀的ＭＲＭ實(shí)驗(yàn)原理如圖１．５所示［２３］。在三個(gè)串聯(lián)的四級(jí)桿中，第一個(gè)四級(jí)桿逡逑（Ｑ１）用于過(guò)濾母離子，只有被預(yù)先選擇的母離子才可以通過(guò)Ｑ１，進(jìn)入第二個(gè)四逡逑級(jí)桿（Ｑ２）。Ｑ２作為碎裂腔，對(duì)于過(guò)濾后的母離子進(jìn)行碎裂，通常是碰撞誘導(dǎo)碎逡逑裂模式（Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ邋ｉｎｄｕｃｅｄ邋ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，ＣＩＤ）。但亦有研宄采用高能碰撞誘導(dǎo)碎裂逡逑模式（Ｈｉｇｈ邋ｅｎｅｒｇｙ邋ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ邋ｉｎｄｕｃｅｄ邋ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，ＨＣＤ），ＨＣＤ邋的靈敏度比邋ＣＩＤ邋好。逡逑第三個(gè)四級(jí)桿（Ｑ３）用于過(guò)濾子離子，只有符合預(yù)先設(shè)定條件的子離子才能通過(guò)Ｑ３，逡逑從而進(jìn)入檢測(cè)器中。多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)技術(shù)通過(guò)選擇目標(biāo)蛋白的特定母離子和子離子對(duì)，逡逑顯著提高了目標(biāo)肽段的信噪比，是一種極具前景的高通量靶向蛋白定量技術(shù)。該技逡逑術(shù)具有靈敏度高、準(zhǔn)確性好、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)

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本文編號(hào)：2712506