【摘要】：黏膜及其相關(guān)的黏膜免疫是機體抵御外界病原體入侵的第一道防線,分泌型IgA(Secretory Immunoglobulin A)抗體(S-IgA)是這道防線中重要的特異性效應因子。與血清型IgG等抗體不同的是,分泌型IgA抗體通常由多聚免疫球蛋白受體(pIgR)介導,在黏膜上皮細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運并被分泌到黏膜腔面,從而賦予IgA進入黏膜上皮細胞內(nèi)的活性并具備在細胞內(nèi)與入侵病原相互作用的機會和能力。研究表明,在分泌型IgA抗體通過黏膜上表皮細胞轉(zhuǎn)運到黏膜腔面的過程中,可在胞內(nèi)與病毒的多種成分特異性相互作用,并能有效抑制病毒在上皮細胞中的復制。因此,IgA抗體具有一種獨特的抵御病毒感染的機制——細胞內(nèi)中和。然而,不同病毒成分特異的IgA抗體在胞內(nèi)如何與病毒相互作用,及相應的分子機制和效應還所知甚少。本論文采用經(jīng)典雜交瘤技術(shù)和梯度稀釋方法篩選得到兩株麻疹病毒P(phosphoprotein)蛋白特異的IgA抗體anti-P 1D11-IgA和anti-P 7F1-IgA,并采用聚碳酸酯膜Transwell極化單層細胞系統(tǒng),對這兩株單克隆IgA抗體與麻疹病毒的胞內(nèi)相互作用、抑制病毒復制的效應及其分子機制進行了系統(tǒng)研究。研究發(fā)現(xiàn):首先兩株IgA抗體都能與Transwell系統(tǒng)中感染麻疹病毒的Vero-pIgR細胞中的病毒P蛋白特異性結(jié)合。進一步驗證IgA抗體的胞內(nèi)中和能力時我們發(fā)現(xiàn):僅anti-P 1D11-IgA抗體在Vero-pIgR細胞中具有胞內(nèi)中和病毒的能力,anti-P 7F1-IgA抗體在同樣干擾素缺陷的Vero-pIgR細胞中無法中和病毒,在Caco-2細胞中卻有顯著抑制病毒復制的能力。這提示我們針對同一靶標抗原的兩株特異性IgA抗體,是通過不同的機制與病毒相互作用,從而抑制病毒復制,因此我們分別針對兩株IgA抗體與病毒作用的分子機制展開了研究。首先我們確認了anti-P 1D11-IgA抗體在麻疹病毒P蛋白上的關(guān)鍵性結(jié)合位點位于P蛋白N端第23位脯氨酸上,經(jīng)過免疫共沉淀實驗檢驗anti-P 1D11-IgA抗體通過干擾P蛋白N端α-分子識別元件(α-MoRE)與麻疹病毒N蛋白的結(jié)合,破壞P-N復合物結(jié)構(gòu)。由于P-N復合物結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定是麻疹病毒基因組轉(zhuǎn)錄復制中心RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp)行使功能的重要基礎(chǔ),因此通過RT-PCR實驗我們發(fā)現(xiàn)anti-P 1D11-IgA抗體在感染病毒的細胞內(nèi)可致使病毒基因組和mRNA合成的減少,最終減少子代病毒的產(chǎn)生。而與anti-P 1D11-IgA抗體不同的是,anti-P 7F1-IgA抗體在麻疹病毒P蛋白上的特異性結(jié)合位點位于P蛋白N端77-86位氨基酸上。并且在感染病毒的Caco-2細胞中發(fā)現(xiàn)anti-P 7F1-IgA抗體的胞內(nèi)中和病毒能力優(yōu)于anti-P 1D11-IgA抗體。通過ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)和RT-PCR(Real Time-Polymerase Chain Reaction)檢測發(fā)現(xiàn)anti-P 7F1-IgA抗體能夠促進IFN-β的產(chǎn)生和干擾素刺激基因的表達,因此我們推測anti-P 7F1-IgA抗體可以通過阻礙病毒免疫逃逸Ⅰ型干擾素來中和病毒。在免疫共沉淀實驗中發(fā)現(xiàn),anti-P 7F1-IgA抗體與麻疹病毒P蛋白的相互作用,阻礙了P蛋白與JAK1蛋白和STAT1蛋白結(jié)合。進一步使用Western Blot監(jiān)測感染細胞中的蛋白表達,確認anti-P 7F1-IgA抗體可使磷酸化的JAK1蛋白和STAT1在感染病毒細胞內(nèi)更早的產(chǎn)生。激光共聚焦觀察也顯示,在anti-P 7F1-IgA抗體存在下,感染病毒的細胞內(nèi)STAT1蛋白能更有效的進行核轉(zhuǎn)位。最終在293T細胞中,我們通過驗證蛋白相互作用證明anti-P 7F1-IgA抗體可以阻礙麻疹病毒P蛋白與JAK1蛋白和STAT1蛋白的結(jié)合,激活I(lǐng)型干擾素信號通路的轉(zhuǎn)導,通過賦予宿主細胞更有效的天然免疫功能來抑制病毒的復制。雖然針對同一靶標抗原——麻疹病毒P蛋白,但是兩株特異性的IgA抗體卻是分別通過破壞病毒基因組轉(zhuǎn)錄復制過程中關(guān)鍵復合物的結(jié)構(gòu)或者通過阻礙病毒逃逸宿主天然免疫這兩種途徑來抵御病原體。這啟示我們IgA抗體在細胞內(nèi)與病毒成分的相互作用不僅僅只是結(jié)合。由于IgA抗體針對病毒結(jié)合的特異性,IgA抗體可以靶向病毒復制過程中的單個關(guān)鍵結(jié)構(gòu)功能組分P蛋白,還可以通過針對病毒基因組轉(zhuǎn)錄復制的重要復合體或者病毒顆粒組裝的核心連接蛋白等來進行中和病毒。另一方面,IgA抗體可以協(xié)調(diào)病毒與細胞相互作用,抑制病毒免疫逃逸的能力,增強細胞天然免疫,并最終發(fā)揮抗病毒功效。總而言之,IgA抗體與病毒相互作用的分子機制的研究,為病毒或者細胞成分是否可作為藥物靶點提供了理論依據(jù),為抗病毒疫苗提供了理論基礎(chǔ)。 【學位授予單位】：中國科學院大學(中國科學院武漢病毒研究所)
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R373.11

【圖文】：

10克隆抗體細胞株。圖1.1.5.2 抗體類別重組成IgA抗體的原理（Janet Stavnezer等2008年撰寫的綜述[39]）Figure 1.1.5.2 Diagram of Ig class switch recombination (CSR) to IgA1.1.6 Transwell 通透膜系統(tǒng)圖1.1.6 Transwell通透膜系統(tǒng)（由周諦晗繪制）Figure 1.1.6 Transwell permeable membrane system本課題主要研究黏膜上皮細胞與分泌型IgA抗體以及病原體之間的關(guān)系，因

.5.2 抗體類別重組成IgA抗體的原理（Janet Stavnezer等2008年撰寫的re 1.1.5.2 Diagram of Ig class switch recombination (CSR) to IgAnswell 通透膜系統(tǒng)

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 ;西游健康新傳之防治麻疹(上篇) 接種疫苗 消除麻疹[J];健康向?qū)?2017年01期

2 吳超;;麻疹防控知識解讀[J];健康博覽;2017年02期

3 程曉光;;西游健康新傳之防治麻疹(下篇)[J];健康向?qū)?2017年02期

4 ;微生物所在麻疹病毒侵入上皮細胞機制研究方面獲得重要突破[J];生命的化學;2012年06期

5 ;流行麻疹病毒基因變化規(guī)律闡明[J];廣州醫(yī)學院學報;2008年01期

6 唐凌云;麻疹病毒及疫苗的研究進展[J];中國生物制品學雜志;1997年04期

7 郝炳華，，陶明;麻疹病毒研究進展[J];國外醫(yī)學.婦幼保健分冊;1995年03期

8 張光明;;中學生麻疹的爆發(fā)[J];預防醫(yī)學情報;1987年06期

9 王雪臣;;活血藥物在麻疹治療中的運用[J];中國社區(qū)醫(yī)師;1987年04期

10 王樹山;;現(xiàn)代麻疹的變化及其診治[J];醫(yī)師進修雜志;1988年02期

相關(guān)會議論文 前10條

1 盧亦愚;;麻疹病毒變異對免疫效果的影響[A];2007年浙江省醫(yī)學病毒學、醫(yī)學微生物與免疫學學術(shù)年會論文匯編[C];2007年

2 李凌云;齊義鵬;渡邊倫子;上田重晴;;控制麻疹病毒血凝集性及病毒與細胞受體結(jié)合作用的重要功能位點[A];面向21世紀的科技進步與社會經(jīng)濟發(fā)展（下冊）[C];1999年

3 賈珍;周毅;劉力斗;;麻疹病毒相關(guān)腦炎一例[A];7th中華醫(yī)學會神經(jīng)病學分會全國中青年神經(jīng)病學學術(shù)大會暨第十屆全國神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病與腦脊液細胞學學術(shù)大會論文匯編[C];2014年

4 唐小敏;左麗;;貴州省2013～2015年麻疹病毒核蛋白基因特征及其變異[A];第十二屆全國免疫學學術(shù)大會摘要匯編[C];2017年

5 ;嬰兒麻疹并重癥肝炎2例臨床分析[A];第十三屆江浙滬兒科學術(shù)會議暨2016年浙江省醫(yī)學會兒科學學術(shù)年會論文匯編[C];2016年

6 宋戰(zhàn)昀;韓文瑜;丁壯;;麻疹病毒細胞膜受體研究進展[A];全國人畜共患病學術(shù)研討會論文集[C];2006年

7 宋戰(zhàn)昀;韓文瑜;丁壯;;麻疹病毒細胞膜受體研究進展[A];中國畜牧獸醫(yī)學會家畜傳染病學分會第六屆理事會第二次會議暨教學專業(yè)委員會第六屆代表大會論文集[C];2006年

8 劉鑫;李其嵐;項榮;齊義鵬;;HAP／RTN3在麻疹病毒誘發(fā)細胞凋亡的過程中的作用及其對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位的依賴性[A];湖北省生物工程學會2004年年會學術(shù)報告及論文摘要匯編[C];2004年

9 張鵬;李凌云;胡淳玲;齊義鵬;;麻疹病毒血凝集素、融合蛋白及其細胞受體SLAM相互作用表明新的融合三聚體模型[A];湖北省生物工程學會2004年年會學術(shù)報告及論文摘要匯編[C];2004年

10 李艷霞;董菊;穆耶賽爾;;運用PDCA程序阻斷麻疹病毒在門診的傳播[A];全國醫(yī)院感染護理學術(shù)交流暨專題講座會議論文匯編[C];2008年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 本報駐美記者 孫剛;麻疹在美爆發(fā)，原因竟是另一種“流行病”[N];解放日報;2019年

2 趙寧波;麻疹再度惹恐慌 中醫(yī)藥可防可控[N];健康報;2019年

3 新華社記者 張瑩;為何麻疹在全球多地卷土重來[N];中國科學報;2019年

4 實習記者 代小佩;麻疹卷土重來 專家說它有克星[N];科技日報;2019年

5 本報記者 李寧;預防麻疹 接種疫苗最為緊要[N];中國人口報;2018年

6 朱貞 中國疾病預防控制所病毒病預防控制中心研究員 記者 白竟楠;消滅麻疹病毒依然任重道遠[N];北京科技報;2016年

7 黃顯斌 唐明山;莫將麻疹惹上身[N];中國醫(yī)藥報;2003年

8 北京地壇醫(yī)院 蔡fg東 張獻懷;“大麻疹”“小麻疹”增多[N];中國醫(yī)藥報;2005年

9 黃顯斌 唐明山;春季謹防麻疹[N];中國中醫(yī)藥報;2003年

10 季衛(wèi)華;早春須防麻疹鬧[N];中國中醫(yī)藥報;2004年

相關(guān)博士學位論文 前8條

1 楊益;IgA與麻疹病毒的胞內(nèi)相互作用[D];中國科學院大學(中國科學院武漢病毒研究所);2019年

2 胡淳玲;麻疹病毒血凝素蛋白與受體的相互作用及麻疹病毒侵染機制研究[D];武漢大學;2004年

3 劉鑫;麻疹病毒通過受體SLAM對昆蟲細胞的感染及其誘發(fā)細胞凋亡的機制研究[D];武漢大學;2005年

4 邊疆;吉林省麻疹流行病學分析及麻疹野病毒的病原學研究[D];吉林大學;2007年

5 胡鈺;吉林省麻疹野毒株病原學及強化免疫對麻疹流行影響的研究[D];吉林大學;2008年

6 孟凡亞;安徽省麻疹發(fā)病影響因素及控制策略研究[D];安徽醫(yī)科大學;2017年

7 魏成國;基于生物信息學的麻疹病毒分子進化及腸道病毒鑒定分型研究[D];吉林大學;2013年

8 涂波;中國北方麻疹患者的臨床特征和流行病學分析[D];中國人民解放軍醫(yī)學院;2016年

相關(guān)碩士學位論文 前10條

1 王春萍;蘭州市城關(guān)區(qū)麻疹流行病學特征及實驗室監(jiān)測分析[D];蘭州大學;2018年

2 高凌玉;2013~2014年我國大陸麻疹病毒血凝素核苷酸和氨基酸變異變遷研究[D];中國疾病預防控制中心;2017年

3 姚肖;兩類麻疹模型分析及中國數(shù)據(jù)擬合[D];華中師范大學;2018年

4 戴秋芝;2013-2016年日照市麻疹流行病學分析[D];青島大學;2018年

5 王瑋;2016年安徽省麻疹空間分布特征分析和病例感染地點調(diào)查[D];安徽醫(yī)科大學;2017年

6 楊珊明;奉化市成人感染麻疹病毒的臨床特點及發(fā)病原因探討[D];浙江大學;2011年

7 李春妍;二氯乙酸協(xié)同低劑量溶瘤麻疹病毒治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤[D];南京大學;2013年

8 周雪蕾;中國麻疹的季節(jié)性動力學分析[D];華中師范大學;2017年

9 相鳳陽;吉林省2013-2014年發(fā)熱伴出疹病例中麻疹病毒和腸道病毒感染狀況的研究[D];吉林大學;2015年

10 劉楊;麻疹病毒基因分型及血清學研究[D];天津醫(yī)科大學;2010年

本文編號：2712131