【摘要】：近年來測序技術(shù)不斷更新,測序成本大大降低。利用高通量測序技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)分析病原微生物的遺傳特征,使我們對微生物的起源、演化、傳播和致病機(jī)制等方面有了更深入的了解。本研究分為兩部分,分別對臨床樣本中細(xì)菌和真菌病原進(jìn)行高通量測序,結(jié)合序列分析和表型驗證試驗,揭示病原的遺傳特征,耐藥性和毒力特點。多耐藥B族鏈球菌基因組序列分析研究目的B族鏈球菌(Group B Streptococcus,GBS)是引發(fā)新生兒感染主要病原之一。然而中國目前對GBS研究還處于初級階段,缺乏對中國GBS菌株的基因組研究。本研究將通過基因組分析,獲得中國GBS菌株的致病分型和耐藥特點,為臨床新生兒GBS感染的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。研究內(nèi)容通過高通量測序和公共數(shù)據(jù)庫基因組數(shù)據(jù)收集,本研究對102株GBS中國株進(jìn)行了分型鑒定,構(gòu)建中國GBS菌群結(jié)構(gòu),結(jié)合菌株致病信息,分析致病菌株分型特點。并對所有菌株進(jìn)行耐藥基因篩查,結(jié)合藥敏試驗驗證,分析中國GBS菌株的耐藥特點和耐藥菌株分布情況。研究方法使用高通量測序技術(shù)獲得臨床樣本中GBS菌株的全基因組序列,并收集公共數(shù)據(jù)庫中GBS中國菌株的測序數(shù)據(jù),通過組裝基因組共得到102株GBS全基因組序列。使用分子分型方法對所有菌株分型。分析基因組數(shù)據(jù)提取核心基因組SNP數(shù)據(jù),系統(tǒng)演化分析構(gòu)建中國GBS種群結(jié)構(gòu)。通過序列比對,篩查GBS基因組中的耐藥基因,分析耐藥基因元件結(jié)構(gòu),并結(jié)合藥敏試驗,測試GBS菌株的耐藥性。研究結(jié)果102株GBS主要分為5個群,中國GBS種群結(jié)構(gòu)與國外報道結(jié)果一致。新生兒感染多由ST17型菌株引起,相比其他菌株ST17型菌株多攜帶有多重耐藥基因。對ST17型菌株進(jìn)一步分析顯示,ST17型菌株在演化過程中分為兩群,主要來自廣州、深圳兩地。ST17型菌株基因組內(nèi)攜帶兩種耐藥基因元件,耐藥菌株對四環(huán)素、大環(huán)內(nèi)酯類和氨基糖苷類抗生素表現(xiàn)出很強的抗性。研究結(jié)論本研究首次從群體水平對中國GBS菌株基因組進(jìn)行分析。分析得到新生兒感染菌株的分型特點,和GBS菌株的耐藥性。耐藥菌株攜帶的耐藥基因元件可以通過水平基因轉(zhuǎn)移使敏感菌株獲得耐藥性。以上結(jié)果表明,在應(yīng)對新生兒GBS感染中要控制抗生素的使用,加快疫苗的開發(fā)與普及,控制耐藥性毒力菌株在抗生素壓力下發(fā)生擴(kuò)張。構(gòu)巢曲霉臨床株基因組注釋研究目的構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans,A.nidulans)是曲霉屬代表性物種,作為遺傳學(xué)研究模式生物已有70多年的歷史。同時構(gòu)巢曲霉也是一種機(jī)會致病菌,感染多見于CGD或免疫缺陷患者,健康人感染構(gòu)巢曲霉十分罕見。我們應(yīng)用多種測序技術(shù),對一株構(gòu)巢曲霉進(jìn)行基因組測序,并進(jìn)行精細(xì)的基因組注釋,為下一步比較基因組學(xué)和系統(tǒng)演化分析奠定基礎(chǔ)。研究內(nèi)容我們從罕見病例樣本中分離得到一株構(gòu)巢曲霉,命名為BJCH M5。我們對這株構(gòu)巢曲霉進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定和形態(tài)學(xué)觀察,并對其進(jìn)行全基因組測序,整合轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)完成了高精度的基因組注釋。研究方法結(jié)合單分子實時測序(Single molecule real time sequencing,SMRT sequencing)技術(shù)和高通量染色體結(jié)構(gòu)捕獲(High throughput chromosome conformation capture,Hi-C)技術(shù),我們對BJCH M5進(jìn)行基因組測序和組裝校正。因真核生物基因結(jié)構(gòu)復(fù)雜,我們整合了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和蛋白質(zhì)組質(zhì)譜數(shù)據(jù)對基因組進(jìn)行注釋,并對注釋結(jié)果進(jìn)行驗證。使用多種生物信息學(xué)軟件和數(shù)據(jù)庫對BJCH M5進(jìn)行功能注釋,最終得到高精度的基因組注釋數(shù)據(jù)。研究結(jié)果我們首次發(fā)現(xiàn)一例無免疫功能缺陷的兒童患有構(gòu)巢曲霉中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的病例,對病原真菌進(jìn)行鑒定和形態(tài)學(xué)觀察。我們發(fā)現(xiàn)臨床菌株BJCH M5與參考菌株FGSC A4表型差異很大,為進(jìn)一步研究BJCH M5的遺傳特征,我們對BJCH M5進(jìn)行全基因組測序和高精度的基因組注釋。BJCH M5共有8條染色體和一條線粒體,全基因組共有10949個基因,編碼11470條轉(zhuǎn)錄本,其中17.6%的轉(zhuǎn)錄本有明確的功能注釋,注釋結(jié)果得到蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)的驗證。研究結(jié)論在本研究中,我們利用最新的測序技術(shù)和全面的數(shù)據(jù)分析流程,克服以往在真菌基因組測序和注釋中的難點,首次獲得了高質(zhì)量的臨床構(gòu)巢曲霉菌株的基因組數(shù)據(jù),為以后的曲霉基因組分析和致病機(jī)制研究奠定了堅實的基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖 1.1 102 株 GBS 核心基因組系統(tǒng)演化關(guān)系以 2603V/R 菌株基因組為參考，使用 RAxML 軟件構(gòu)建 102 株 GBS 演化關(guān)系，構(gòu)建基于核心基因組比對生成的 26406 個 SNP 位點；圖中注釋為（由外到內(nèi)）：菌株收集時間，基因組中耐藥基因個數(shù)，宿主情況和 MLST 分型結(jié)果。每株菌用不同顏色圓圈標(biāo)記血清型鑒定結(jié)果1.3.2 ST17 型菌株含有多種耐藥基因ST17 菌株具有引發(fā)新生兒感染和攜帶多個耐藥基因兩個特點。進(jìn)一步的系統(tǒng)演化分析顯示（圖 1.2），本研究中 38 株 ST17 菌株在演化過程中形成兩個主要分支，分別命名為 I 群和 II 群，其中 I 群 23 株菌，II 群 15 株菌。ST17 菌株中有 35株來自廣州和深圳，兩群菌株在兩地呈現(xiàn)混合狀態(tài)。耐藥基因篩查結(jié)果顯示 ST17多耐藥菌株基因組攜帶四環(huán)素、大環(huán)內(nèi)酯類和氨基糖苷類抗生素抗性基因，部分菌株還攜帶林可酰胺類抗生素抗性基因。ST17 兩群菌株攜帶的耐藥基因不同，，I第 17 頁

圖 1.2 ST17 型 GBS 耐藥基因分布基因組為參考，使用 RAxML 軟件構(gòu)建 38 株 ST17 菌株系統(tǒng)發(fā)生對中的 1972 個 SNP 位點，B83（1970 年分離）為外群菌株，用粗鑒定基因組中耐藥基因，耐藥基因按抗生素類別標(biāo)記顏色，灰色兩個主要演化分支用不同顏色表示藥表型與攜帶耐藥基因相關(guān)，藥敏試驗結(jié)果（表 1.3）顯示霉素、頭孢吡肟和萬古霉素敏感，菌株 BJCH_SA3、B對四環(huán)素耐受，菌株 BJCH_SA1 、BJCH_SA2 和 BJCH_S
【學(xué)位授予單位】：軍事科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R378

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本文編號：2711811