【摘要】：目的本研究將LMP1與人IL-2基因融合后構(gòu)建重組質(zhì)粒,并將構(gòu)建的重組質(zhì)粒載體通過電轉(zhuǎn)導(dǎo)入感受態(tài)卡介苗(BCG),獲得能夠穩(wěn)定表達(dá)融合蛋白的重組BCG(rBCG),通過對構(gòu)建的EB病毒陽性鼻咽癌動物模型腫瘤生長的抑制情況檢測rBCG的免疫效果,為研發(fā)既能抗結(jié)核病又能對EB病毒陽性腫瘤產(chǎn)生免疫的雙價(jià)疫苗奠定了基礎(chǔ)。方法從EB病毒陽性的B95-8細(xì)胞中提取總RNA,通過RT-PCR獲得cDNA,以此為模板擴(kuò)增獲得LMP1,以IL-2 pMalLP質(zhì)粒為模板擴(kuò)增獲得IL-2,利用重疊PCR(overlap-PCR)將兩段基因進(jìn)行融合獲得融合基因,將酶切后的融合基因與酶切的穿梭表達(dá)質(zhì)粒pMV261進(jìn)行連接,對獲得的重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切、PCR、測序鑒定,將鑒定正確的重組質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)導(dǎo)入BCG感受態(tài)細(xì)胞。通過溫度誘導(dǎo)促進(jìn)融合基因的表達(dá),利用western-blot檢測目的蛋白的表達(dá)。構(gòu)建EB病毒陽性鼻咽癌動物模型,利用獲得的rBCG對實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行免疫,定期測量腫瘤組織長徑和短徑并計(jì)算其體積。一段時(shí)間后將實(shí)驗(yàn)動物處死,獲取腫瘤組織,稱重并計(jì)算腫瘤組織抑制率,HE染色觀察炎性細(xì)胞浸潤情況。結(jié)果從B95-8細(xì)胞中提取的總RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶清晰,明暗分明,質(zhì)量較好,利用PT-PCR獲得了LMP1全長cDNA,并以cDNA為模板設(shè)計(jì)特引物擴(kuò)增獲得了1225 bp的LMP1。以含目的基因IL-2的質(zhì)粒為模板擴(kuò)增獲得453 bp IL-2,利用overlap-PCR擴(kuò)增獲得1623bp IL-2-LMP1融合基因。將融合基因連接到質(zhì)粒pMV261,經(jīng)篩選、克隆后進(jìn)行PCR、酶切、測序鑒定。PCR擴(kuò)增獲得1600bp左右的片段,與融合基因大小基本一致,酶切獲得1600bp與4500bp左右兩條片段,大小與預(yù)期一致,測序結(jié)果顯示該融合基因序列與已知序列一致性為100%。利用電轉(zhuǎn)儀將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒導(dǎo)入BCG感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)溫度誘導(dǎo)后利用western-blot可以檢測到外源基因融合蛋白的表達(dá)。在動物實(shí)驗(yàn)中rBCG組、BCG組、PBS組成瘤時(shí)間無明顯差異,各組腫瘤體積無明顯差異。免疫接種后同一時(shí)間rBCG組腫瘤體積小于PBS組和BCG組,BCG組小于PBS組。rBCG組平均瘤重小于BCG組、PBS組,BCG組與PBS組之間無明顯差異,rBCG組腫瘤抑制率38.00%高于BCG組11.91%。腫瘤組織HE染色結(jié)果顯示,rBCG組腫瘤組織有明顯的淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤。結(jié)論構(gòu)建獲得了pMV261-IL-2-LMP1重組質(zhì)粒,并成功將重組質(zhì)粒導(dǎo)入BCG,獲得了能夠穩(wěn)定表達(dá)融合蛋白的rBCG,構(gòu)建的rBCG對EB病毒陽性鼻咽癌腫瘤具有抑制作用。
【圖文】：

濟(jì)南大學(xué)碩士學(xué)位論文病毒永生化的 B95-8 細(xì)胞提取總 RNA，利用 RT-PCR 合成 cDNA,引物合成 LMP1 全部序列。以質(zhì)粒 IL-2 pMalLP 為模板設(shè)計(jì)引物合在引物中引入 Linker（Gly4Ser）3，利用重疊 PCR 將兩段目的基因基因。將融合基因連接到 pMV261 載體上,將通過 PCR、酶切、測質(zhì)粒 pMV261-IL-2-LMP1 通過電轉(zhuǎn)導(dǎo)入感受態(tài) BCG。將通過抗生度誘導(dǎo)促進(jìn)融合蛋白的表達(dá)，使用 western-blot 檢測融合基因在 B案與技術(shù)路線

圖 2 實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線圖Fig.2 Experimental technology roadmap.2 EB 病毒總 RNA 的提取.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：使用含 10%胎牛血清的 RIMI 1640 復(fù)蘇 B95-8 細(xì)胞，初次接收細(xì)胞時(shí)將細(xì)胞在室溫下靜置半小時(shí)然后用 75%酒精對培養(yǎng)瓶進(jìn)行消毒處理。將培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到紫外照射的生物安全柜中，將培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液取出 1000 r/min 離心 4min，將原來培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)瓶中。使用新的培養(yǎng)基將細(xì)胞沉淀吹打混勻后分裝到新的加入培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中置于 CO2生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，同時(shí)取部分沉淀使用原來的培養(yǎng)基行培養(yǎng)以最大程度保持細(xì)胞原來的生活條件，防止細(xì)胞對不同廠家培養(yǎng)基的適應(yīng)性存差別而造成損失。B95-8 細(xì)胞為半懸浮半貼壁生長細(xì)胞，細(xì)胞換液、傳代時(shí)應(yīng)注意將胞充分吹打混勻否則容易聚集成團(tuán)，造成生長緩慢甚至死亡。此外，，操作過程中應(yīng)注
【學(xué)位授予單位】：濟(jì)南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R392

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本文編號：2708144