【摘要】：精子是父源遺傳信息的傳遞者,精子發(fā)生障礙是雄性不育的重要原因之一。精子發(fā)生相關(guān)調(diào)控機(jī)制的研究對(duì)不育癥的診療具有重要的意義。非編碼小RNA對(duì)精子發(fā)生的調(diào)控作用一直是生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。生精細(xì)胞中最主要的非編碼小RNA包括:microRNAs(miRNA)、內(nèi)源小干擾RNA(endogenous small interfering RNAs,endo-siRNAs)以及piRNA(PIWI-interacting RNA)。piRNA與PIWI蛋白結(jié)合形成piRNA介導(dǎo)的沉默復(fù)合體(piRNA-induced silencing complexes,piRISC),主要參與轉(zhuǎn)座子沉默,維持生殖細(xì)胞基因組的完整性。piRNA-PIWI蛋白復(fù)合體還參與前精原細(xì)胞新生DNA甲基化重建,并調(diào)節(jié)圓形精子中某些編碼RNA的表達(dá),在精子發(fā)生的許多階段發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。piRNA的生成包括初級(jí)piRNA生成通路和次級(jí)piRNA生成通路。初級(jí)piRNA生成通路始于piRNA長(zhǎng)鏈前體的轉(zhuǎn)錄,隨后piRNA長(zhǎng)鏈前體在核酸內(nèi)切酶Zuc/MitoPLD的作用下被切割為piRNA中間體;piRNA中間體與PIWI蛋白結(jié)合,發(fā)生3’末端核酸外切及2’-O-甲基化修飾,形成成熟的初級(jí)piRNA。次級(jí)piRNA的成熟同樣需要3’末端核酸外切及甲基化修飾。參與piRNA中間體3’端截短的核酸外切酶一直是piRNA研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)話題。一項(xiàng)在蠶中的研究顯示,Parn核酸外切酶家族成員—Pnldc1參與piRNA中間體3’端核酸外切。另一項(xiàng)線蟲中的研究顯示,Pnldc1在線蟲中的同源基因Parn-1同樣參與piRNA中間體3’端核酸外切。然而,哺乳類動(dòng)物Pnldc1的具體功能還未見報(bào)道。本研究中,我們嘗試對(duì)小鼠Pnldc1的分子功能及其對(duì)精子發(fā)生的影響進(jìn)行了探究。首先,我們對(duì)小鼠Pnldc1的表達(dá)模式進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)小鼠Pnldc1呈睪丸特異性表達(dá)。小鼠Pnldc1高表達(dá)于出生后1-3周的睪丸中,而在出生后4-8周逐漸下降。進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Pnldc1在小鼠精原細(xì)胞、精母細(xì)胞及圓形精子中均有表達(dá)。隨后,我們應(yīng)用CRISPR/Cas 9技術(shù)構(gòu)建了Pnldc1特異性敲除小鼠。Pnldc1純合敲除小鼠附睪中無(wú)正常精子,睪丸減小,雄性完全不育。睪丸組織形態(tài)學(xué)觀察顯示:Pnldc1純合敲除小鼠出現(xiàn)混合精子發(fā)生障礙:一部分生精細(xì)胞阻滯于減數(shù)分裂期,另一部分生精細(xì)胞阻滯于精子變形階段。生理狀態(tài)下,生精細(xì)胞中的轉(zhuǎn)座子受到piRNA調(diào)控而處于沉默狀態(tài)。轉(zhuǎn)座子的異常激活往往提示piRNA生成出現(xiàn)障礙。對(duì)Pnldc1純合敲除小鼠生精細(xì)胞中反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子LINE1的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)LINE1在生精細(xì)胞中異常高表達(dá),提示Pnldc1純合敲除小鼠生精細(xì)胞中piRNA生成存在異常。我們遂對(duì)Pnldc1敲除小鼠生精細(xì)胞中piRNA通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)敲除鼠中MILI、MIWI、TDRD1以及TDRKH的定位出現(xiàn)了異常極化。線粒體及線粒體間致密物(IMC)與piRNA生成過程關(guān)系密切,許多piRNA通路相關(guān)基因敲除后,都將影響IMC的形成及線粒體在生精細(xì)胞中的分布。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn),Pnldc1敲除后小鼠精母細(xì)胞中IMC可以形成,但線粒體的分布出現(xiàn)極化。我們進(jìn)一步探究敲除Pnldc1對(duì)piRNA生成的影響。首先,我們借助長(zhǎng)鏈RNA測(cè)序數(shù)據(jù)對(duì)Pnldc1敲除鼠中piRNA長(zhǎng)鏈前體進(jìn)行定量。定量結(jié)果顯示,Pnldc1敲除不影響piRNA長(zhǎng)鏈前體的表達(dá)。接著,小RNA測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)Pnldc1敲除后piRNA中間體產(chǎn)生不受影響,而其3’末端核酸外切過程出現(xiàn)障礙。綜上所述:小鼠Pnldc1不影響piRNA長(zhǎng)鏈前體及中間體的產(chǎn)生,主要參與piRNA中間體3’末端截短過程,影響piRNA的成熟。Pnldc1敲除后,3’端延長(zhǎng)的piRNA轉(zhuǎn)座子沉默能力發(fā)生障礙,反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子LINE1異常激活,生精細(xì)胞基因組完整性受到破壞。同時(shí),piRNA 3’端延長(zhǎng)后,其對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控能力發(fā)生改變,Pnldc1敲除鼠生精細(xì)胞中編碼蛋白基因表達(dá)出現(xiàn)紊亂,最終導(dǎo)致精子發(fā)生障礙和雄性不育。
【圖文】：

PNLDC1及PARN多物種序列相似性分析。紅線標(biāo)出的是小酸酶結(jié)構(gòu)域，藍(lán)線標(biāo)出的是小鼠 PNLDC1 蛋白可能存在的跨蠶、人類、小鼠等物種中均有表達(dá)，且具有較高的保守性白 PARN 在線蟲和果蠅中表達(dá)。黃色表示在上述各物種間均色、綠色表示不全保守，無(wú)色表示均不保守。1 的 mRNA 在成年小鼠主要臟器中的表達(dá)模式周齡 C57BL/6 雄性小鼠主要臟器（心、肝、脾、肺、腎、肌 巢 、 睪 丸 ） 抽 提 總 RNA, 逆 轉(zhuǎn) 錄 為 cDNA 。ww.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢到小鼠 Pnldc1 存在多性針對(duì)小鼠 Pnldc1 并可同時(shí)識(shí)別多個(gè)轉(zhuǎn)錄本的引物進(jìn)行 qnldc1 mRNA 在成年小鼠主要臟器中的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯成年小鼠睪丸組織中特異性表達(dá)（圖 2）。這一結(jié)果與已有的關(guān)的報(bào)道相一致[40, 41]。

針對(duì)小鼠 Pnldc1 且可同時(shí)識(shí)別多個(gè)轉(zhuǎn)錄本的引物進(jìn)行 qPnldc1 mRNA 在各周齡小鼠睪丸組織中的表達(dá)情況。Pnldc齡的小鼠睪丸中即可檢測(cè)到，，隨后在 2 周齡、3 周齡持續(xù)現(xiàn)下降。在小鼠睪丸的發(fā)育過程中，出生后 1 周到 3 周分化為圓形精子的時(shí)期，4 周到 5 周為第一波長(zhǎng)形精子出示 Pnldc1 mRNA 在精原細(xì)胞、精母細(xì)胞及圓形精子中表一結(jié)果，我們應(yīng)用 STA-PUT 重力沉降法分離出 8 周齡小細(xì)胞（pachytene spermatocyte, pacSC）以及圓形精子（roun用體外培養(yǎng)分離出小鼠精原干細(xì)胞（spermatogonial stem 細(xì)胞的總 RNA, 逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，檢測(cè) Pnldc1 mRNA 在情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與各周齡表達(dá)模式基本一致（圖 4）。綜 mRNA 在精原細(xì)胞、精母細(xì)胞及圓形精子中表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R698.2;R-332

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本文編號(hào)：2708129