【摘要】：成體干細胞衰老是個體衰老、組織器官衰老及各種衰老相關疾病發(fā)生的主要原因。衰老個體中組織器官的功能破壞與成體干細胞數(shù)量的減少及功能降低密切相關。作為干細胞研究領域和再生醫(yī)學領域種子細胞的主要來源,間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)隨著體外傳代培養(yǎng)次數(shù)增加,其增殖活性和存活能力降低,多向分化潛能也隨之減弱,這是制約患者自體干細胞移植療效的主要因素之一,也導致了MSCs臨床應用的局限性。因此,調(diào)控衰老的干細胞“重返青春”以改善衰老相關表型,治療衰老相關性疾病,是老年醫(yī)學領域和干細胞研究領域的重大科學問題。本課題組的前期工作發(fā)現(xiàn):衰老MSCs中mi R-34a表達升高,而NAD含量降低,mi R-34a可能通過影響NAD合成促進MSCs衰老。NAD作為細胞能量轉(zhuǎn)化的重要輔酶,能夠參與多種代謝途徑,如糖代謝。葡萄糖代謝通路的多個步驟都涉及到NAD轉(zhuǎn)化為NADH以及NAD再生。NAD耗竭與細胞衰老及能量代謝紊亂密切相關。有研究顯示干細胞的代謝方式以糖酵解為主。mi R-34a與多個糖代謝相關基因如己糖激酶1(HK1)、乳酸脫氫酶(LDHA)等存在潛在的結合位點。由此我們推測,在MSCs衰老過程中,mi R-34a可能通過靶向糖代謝相關基因來影響細胞糖代謝,進而調(diào)控干細胞的衰老。本研究以1-2月齡雄性Wistar大鼠為實驗動物對象,首先通過全骨髓貼壁法和體外傳代培養(yǎng)法獲得P2和P10代MSCs,建立體外MSCs復制性衰老模型,然后通過葡萄糖消耗量、乳酸分泌水平、ATP含量和ECAR水平的檢測,確定MSCs的主要代謝方式以及衰老細胞糖代謝水平的變化;其次利用RNA seq技術和代謝組學技術對年輕與衰老MSCs進行基因表達差異及代謝產(chǎn)物的檢測,篩選出糖代謝相關的差異表達基因,并分析MSCs衰老過程中代謝產(chǎn)物的變化;進一步利用基因過表達技術,探討mi R-34a對MSCs衰老和細胞糖代謝的影響;最后通過生物信息學預測及雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灤_定HK1為mi R-34a的直接靶基因,并通過RT-q PCR技術檢測mi R-34a對HK1表達的影響,探討HK1對MSCs糖代謝和衰老的調(diào)控作用,并通過功能回復實驗進一步闡明mi R-34a通過影響細胞糖代謝參與調(diào)控MSCs衰老的潛在分子機制。實驗結果如下:1、與P2MSCs相比,P10MSCs形態(tài)發(fā)生明顯改變,胞體鋪展、邊界不清晰,細胞表面積增加而長寬比降低;SA-β-gal染色顯示衰老細胞陽性率明顯升高,衰老相關因子P16INK4a和Rb1 m RNA的表達顯著上調(diào);后續(xù)實驗以P2MSCs為年輕細胞,P10MSCs為衰老細胞。2、衰老MSCs的葡萄糖消耗量、乳酸分泌水平、ATP含量及ECAR水平明顯低于年輕MSCs;2-DG處理后,兩組細胞的糖代謝水平均顯著降低。3、RNA seq結果顯示,與年輕MSCs相比,衰老MSCs中共有2874個基因的表達具有顯著差異性,其中包括上調(diào)基因868個和下調(diào)基因2006個。上調(diào)和下調(diào)基因的GO和KEGG Pathway富集分析結果顯示,組織器官發(fā)育和細胞分化等生物進程和通路主要富集于衰老MSCs;而細胞代謝、基礎代謝和輔因子代謝等通路在衰老MSCs中明顯下調(diào)。根據(jù)以上分析結果,鑒定篩選出HK1、PFK1和PK等具有顯著差異的糖代謝相關基因。4、代謝組學檢測結果顯示,在衰老MSCs中共有22個代謝產(chǎn)物具有顯著差異性。差異代謝產(chǎn)物的Pathway分析結果顯示,衰老MSCs中賴氨酸降解和嘌呤代謝等通路顯著降低,而不飽和脂肪酸生成通路則明顯上調(diào)。對RNA seq和代謝組學數(shù)據(jù)進行關聯(lián)分析發(fā)現(xiàn),衰老MSCs中的果糖與甘露糖代謝以及糖酵解/糖異生等途徑變化顯著。5、衰老MSCs中mi R-34a表達明顯高于年輕細胞;過表達mi R-34a使年輕MSCs中衰老細胞陽性率顯著升高,衰老相關因子表達明顯上調(diào);過表達mi R-34a使細胞葡萄糖消耗量和乳酸分泌水平降低,細胞內(nèi)ATP含量和ECAR水平下降。6、生物信息學預測顯示mi R-34a與HK1 m RNA 3’-UTR區(qū)存在潛在的互補結合位點;雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實HK1為mi R-34a的直接靶基因;RT-q PCR進一步證實mi R-34a能夠調(diào)控HK1 m RNA的表達。7、過表達HK1使衰老MSCs的糖代謝水平明顯上調(diào);細胞胞體變細變長,立體感增強,衰老細胞陽性率顯著降低。8、在年輕MSCs中共表達mi R-34a和HK1,能夠上調(diào)mi R-34a過表達引起的HK1 m RNA表達下調(diào),并抑制mi R-34a過表達引起的細胞衰老。綜上所述,MSCs的代謝方式以糖酵解為主,衰老MSCs中細胞糖代謝水平顯著降低;HK1為mi R-34a的直接靶基因,mi R-34a通過靶向HK1影響細胞糖代謝,進而實現(xiàn)其對MSCs衰老的調(diào)控。本研究從代謝組學及表觀遺傳學角度揭示mi R-34a-HK1通過影響細胞糖代謝參與調(diào)控干細胞衰老的潛在分子機制,為解決干細胞衰老所致的種子細胞不足問題提供實驗依據(jù),也為延緩干細胞衰老、激活衰老的干細胞“重返青春”開辟了新思路。
【圖文】：

圖 3.1 大鼠 MSCs 形態(tài)學特征 (**P<0.01,***P<0.001)A.相差顯微鏡觀察(Bar=50μm) B.細胞表面積 C.細胞長寬比老 MSCs 的 SA-β-gal 活性檢測

圖 3.2 大鼠 MSCs 的衰老檢測 (***P<0.001)A.SA-β-gal 染色(Bar=50μm) B.衰老細胞定量分析3.3 衰老 MSCs 中衰老相關因子 mRNA 水平的檢測
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R329.2

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