發(fā)布時(shí)間：2020-06-11 00:02

【摘要】：成體干細(xì)胞衰老是個(gè)體衰老、組織器官衰老及各種衰老相關(guān)疾病發(fā)生的主要原因。衰老個(gè)體中組織器官的功能破壞與成體干細(xì)胞數(shù)量的減少及功能降低密切相關(guān)。作為干細(xì)胞研究領(lǐng)域和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域種子細(xì)胞的主要來(lái)源,間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)隨著體外傳代培養(yǎng)次數(shù)增加,其增殖活性和存活能力降低,多向分化潛能也隨之減弱,這是制約患者自體干細(xì)胞移植療效的主要因素之一,也導(dǎo)致了MSCs臨床應(yīng)用的局限性。因此,調(diào)控衰老的干細(xì)胞“重返青春”以改善衰老相關(guān)表型,治療衰老相關(guān)性疾病,是老年醫(yī)學(xué)領(lǐng)域和干細(xì)胞研究領(lǐng)域的重大科學(xué)問(wèn)題。本課題組的前期工作發(fā)現(xiàn):衰老MSCs中mi R-34a表達(dá)升高,而NAD含量降低,mi R-34a可能通過(guò)影響NAD合成促進(jìn)MSCs衰老。NAD作為細(xì)胞能量轉(zhuǎn)化的重要輔酶,能夠參與多種代謝途徑,如糖代謝。葡萄糖代謝通路的多個(gè)步驟都涉及到NAD轉(zhuǎn)化為NADH以及NAD再生。NAD耗竭與細(xì)胞衰老及能量代謝紊亂密切相關(guān)。有研究顯示干細(xì)胞的代謝方式以糖酵解為主。mi R-34a與多個(gè)糖代謝相關(guān)基因如己糖激酶1(HK1)、乳酸脫氫酶(LDHA)等存在潛在的結(jié)合位點(diǎn)。由此我們推測(cè),在MSCs衰老過(guò)程中,mi R-34a可能通過(guò)靶向糖代謝相關(guān)基因來(lái)影響細(xì)胞糖代謝,進(jìn)而調(diào)控干細(xì)胞的衰老。本研究以1-2月齡雄性Wistar大鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)象,首先通過(guò)全骨髓貼壁法和體外傳代培養(yǎng)法獲得P2和P10代MSCs,建立體外MSCs復(fù)制性衰老模型,然后通過(guò)葡萄糖消耗量、乳酸分泌水平、ATP含量和ECAR水平的檢測(cè),確定MSCs的主要代謝方式以及衰老細(xì)胞糖代謝水平的變化;其次利用RNA seq技術(shù)和代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)年輕與衰老MSCs進(jìn)行基因表達(dá)差異及代謝產(chǎn)物的檢測(cè),篩選出糖代謝相關(guān)的差異表達(dá)基因,并分析MSCs衰老過(guò)程中代謝產(chǎn)物的變化;進(jìn)一步利用基因過(guò)表達(dá)技術(shù),探討mi R-34a對(duì)MSCs衰老和細(xì)胞糖代謝的影響;最后通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)及雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)確定HK1為mi R-34a的直接靶基因,并通過(guò)RT-q PCR技術(shù)檢測(cè)mi R-34a對(duì)HK1表達(dá)的影響,探討HK1對(duì)MSCs糖代謝和衰老的調(diào)控作用,并通過(guò)功能回復(fù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步闡明mi R-34a通過(guò)影響細(xì)胞糖代謝參與調(diào)控MSCs衰老的潛在分子機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:1、與P2MSCs相比,P10MSCs形態(tài)發(fā)生明顯改變,胞體鋪展、邊界不清晰,細(xì)胞表面積增加而長(zhǎng)寬比降低;SA-β-gal染色顯示衰老細(xì)胞陽(yáng)性率明顯升高,衰老相關(guān)因子P16INK4a和Rb1 m RNA的表達(dá)顯著上調(diào);后續(xù)實(shí)驗(yàn)以P2MSCs為年輕細(xì)胞,P10MSCs為衰老細(xì)胞。2、衰老MSCs的葡萄糖消耗量、乳酸分泌水平、ATP含量及ECAR水平明顯低于年輕MSCs;2-DG處理后,兩組細(xì)胞的糖代謝水平均顯著降低。3、RNA seq結(jié)果顯示,與年輕MSCs相比,衰老MSCs中共有2874個(gè)基因的表達(dá)具有顯著差異性,其中包括上調(diào)基因868個(gè)和下調(diào)基因2006個(gè)。上調(diào)和下調(diào)基因的GO和KEGG Pathway富集分析結(jié)果顯示,組織器官發(fā)育和細(xì)胞分化等生物進(jìn)程和通路主要富集于衰老MSCs;而細(xì)胞代謝、基礎(chǔ)代謝和輔因子代謝等通路在衰老MSCs中明顯下調(diào)。根據(jù)以上分析結(jié)果,鑒定篩選出HK1、PFK1和PK等具有顯著差異的糖代謝相關(guān)基因。4、代謝組學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示,在衰老MSCs中共有22個(gè)代謝產(chǎn)物具有顯著差異性。差異代謝產(chǎn)物的Pathway分析結(jié)果顯示,衰老MSCs中賴氨酸降解和嘌呤代謝等通路顯著降低,而不飽和脂肪酸生成通路則明顯上調(diào)。對(duì)RNA seq和代謝組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn),衰老MSCs中的果糖與甘露糖代謝以及糖酵解/糖異生等途徑變化顯著。5、衰老MSCs中mi R-34a表達(dá)明顯高于年輕細(xì)胞;過(guò)表達(dá)mi R-34a使年輕MSCs中衰老細(xì)胞陽(yáng)性率顯著升高,衰老相關(guān)因子表達(dá)明顯上調(diào);過(guò)表達(dá)mi R-34a使細(xì)胞葡萄糖消耗量和乳酸分泌水平降低,細(xì)胞內(nèi)ATP含量和ECAR水平下降。6、生物信息學(xué)預(yù)測(cè)顯示mi R-34a與HK1 m RNA 3’-UTR區(qū)存在潛在的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn);雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)HK1為mi R-34a的直接靶基因;RT-q PCR進(jìn)一步證實(shí)mi R-34a能夠調(diào)控HK1 m RNA的表達(dá)。7、過(guò)表達(dá)HK1使衰老MSCs的糖代謝水平明顯上調(diào);細(xì)胞胞體變細(xì)變長(zhǎng),立體感增強(qiáng),衰老細(xì)胞陽(yáng)性率顯著降低。8、在年輕MSCs中共表達(dá)mi R-34a和HK1,能夠上調(diào)mi R-34a過(guò)表達(dá)引起的HK1 m RNA表達(dá)下調(diào),并抑制mi R-34a過(guò)表達(dá)引起的細(xì)胞衰老。綜上所述,MSCs的代謝方式以糖酵解為主,衰老MSCs中細(xì)胞糖代謝水平顯著降低;HK1為mi R-34a的直接靶基因,mi R-34a通過(guò)靶向HK1影響細(xì)胞糖代謝,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)其對(duì)MSCs衰老的調(diào)控。本研究從代謝組學(xué)及表觀遺傳學(xué)角度揭示mi R-34a-HK1通過(guò)影響細(xì)胞糖代謝參與調(diào)控干細(xì)胞衰老的潛在分子機(jī)制,為解決干細(xì)胞衰老所致的種子細(xì)胞不足問(wèn)題提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),也為延緩干細(xì)胞衰老、激活衰老的干細(xì)胞“重返青春”開(kāi)辟了新思路。
【圖文】：

圖 3.1 大鼠 MSCs 形態(tài)學(xué)特征 (**P<0.01,***P<0.001)A.相差顯微鏡觀察(Bar=50μm) B.細(xì)胞表面積 C.細(xì)胞長(zhǎng)寬比老 MSCs 的 SA-β-gal 活性檢測(cè)

圖 3.2 大鼠 MSCs 的衰老檢測(cè) (***P<0.001)A.SA-β-gal 染色(Bar=50μm) B.衰老細(xì)胞定量分析3.3 衰老 MSCs 中衰老相關(guān)因子 mRNA 水平的檢測(cè)
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R329.2

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本文編號(hào)：2707067