【摘要】：目的:本文旨在對前列腺癌細(xì)胞來源的外泌體在誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化中的作用及其機(jī)制進(jìn)行研究。方法:(1)前列腺癌細(xì)胞來源的外泌體(PCa-exos)的分離與鑒定:培養(yǎng)PC-3M-2B4、PC-3M-IE8兩種前列腺癌細(xì)胞,采用Millipore超濾法提取條件培養(yǎng)基中的外泌體。磷鎢酸染色后通過透射電子顯微鏡對外泌體進(jìn)行形態(tài)上的觀察,用納米粒徑分析技術(shù)對所提外泌體的顆粒大小進(jìn)行鑒定,用Western印跡檢測外泌體表面的特異性分子標(biāo)志。(2)PCa-exos誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化:培養(yǎng)THP-1細(xì)胞并用誘導(dǎo)為巨噬細(xì)胞(Macrophage,Mφ),加入LPS(15 ng/ml)和IFN-γ(50 ng/ml)共同刺激巨噬細(xì)胞48h后為M1亞型,加入IL-4(25 ng/ml)刺激巨噬細(xì)胞48h后為M2亞型。將所提外泌體(100 ug/ml)加入到巨噬細(xì)胞中,48h后為2B4-exo-Mφ與IE8-exo-Mφ型;用綠色熒光PKH67標(biāo)記的PCa-exos加入到巨噬細(xì)胞中,觀察外泌體是否能被巨噬細(xì)胞吸收以及觀察其吸收效率;用CD206抗體對巨噬細(xì)胞表面進(jìn)行熒光染色分型鑒定;用q-PCR、ELISA法檢測誘導(dǎo)后的巨噬細(xì)胞及其上清中IL-10、IL-1β等因子的表達(dá);用Western印跡檢測巨噬細(xì)胞經(jīng)不同誘導(dǎo)處理后細(xì)胞中mTOR、AKT、STAT3及其磷酸化蛋白的表達(dá)水平。(3)PCa-exos中miRNAs分析:用q-PCR檢測提取的外泌體中l(wèi)et-7b等microRNAs的表達(dá)。(4)PCa-exos誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn):用Transwell細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)和體外血管生成實(shí)驗(yàn)檢測各組巨噬細(xì)胞上清對前列腺癌細(xì)胞的侵襲能力及血管生成能力的影響。結(jié)果:(1)電鏡、納米粒徑分析結(jié)果和Western印跡顯示外泌體能通過Millipore超濾方法富集、分離,形態(tài)多為圓形,有典型的茶托狀結(jié)構(gòu),直徑約在40~160 nm,且表面具有外泌體表面特異性分子標(biāo)志CD63和TGS101。(2)外泌體在24h內(nèi)能被巨噬細(xì)胞大量吸收,2B4-exo被巨噬細(xì)胞吸收的攝取率約為70%,IE8-exo被巨噬細(xì)胞吸收的攝取率約為64%;經(jīng)PCa-exos誘導(dǎo)后的巨噬細(xì)胞組中CD206熒光顯示強(qiáng)烈,與M2亞型巨噬細(xì)胞表達(dá)類似,陽性細(xì)胞數(shù)分別占總細(xì)胞數(shù)的77%和90%;q-PCR、ELISA法檢測IL-10、IL-1β等炎癥因子的表達(dá)趨勢符合M2/TAM亞型巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子表達(dá)譜;Western印跡檢測出經(jīng)PCa-exos誘導(dǎo)后的巨噬細(xì)胞其AKT、STAT3的磷酸化蛋白表達(dá)水平增高。(3)q-PCR結(jié)果顯示所提的外泌體中富含miR-23c、miR-451a、let-7b等microRNAs。(4)Transwell細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)和體外血管生成實(shí)驗(yàn)表明經(jīng)PCa-exos誘導(dǎo)后巨噬細(xì)胞組的上清能夠促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的侵襲和血管生成能力。結(jié)論:通過Millipore超濾的方法能夠提取出符合實(shí)驗(yàn)要求的外泌體PCa-exos,其能被巨噬細(xì)胞吸收,且約在24 h時達(dá)到對外泌體吸收的飽和狀態(tài);PCa-exos能夠?qū)⒕奘杉?xì)胞誘導(dǎo)為類似M2的表型;2B4-exo和IE8-exo中富含大量的microRNAs,他們可能通過激活A(yù)KT和STAT3蛋白將巨噬細(xì)胞極化為M2亞型;PCa-exos誘導(dǎo)后的巨噬細(xì)胞的上清可以促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞PC-3M-2B4和PC-3M-IE8的侵襲和體外血管生成能力。
【圖文】：

圖 3.1 通過超濾法得到的 PCa-exos 的分析與鑒定 （A）：透射電子顯微鏡下由PC-3M-2B4、PC-3M-IE8 細(xì)胞條件培養(yǎng)基中得到的 2B4-exo、IE8-exo 形態(tài)圖；（B）2B4-exo和 IE8-exo 的粒徑分析結(jié)果圖；（C）：2B4-exo 和 IE8-exo 表面外泌體特異性分子標(biāo)志 TSG101和 CD63 表達(dá)3.2 巨噬細(xì)胞吸收 PCa-exos為了驗(yàn)證超濾提出的 2B4-exo 和 IE8-exo 是否能夠進(jìn)入到巨噬細(xì)胞進(jìn)而發(fā)揮其生物學(xué)作用進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，我們用 PKH67 綠色熒光染料對外泌體進(jìn)行染色，將已用熒光標(biāo)記后的 2B4-exo 和 IE8-exo 各 50μl 加入到已提前接種巨噬細(xì)胞的96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，輕微混勻，分別在加入 4 h、12 h、24 h、48 h 后，選取合適視野，在普通顯微鏡和熒光顯微鏡下拍照，每組 3 個復(fù)孔，每孔 3 個視野，觀察各組巨噬細(xì)胞表面熒光強(qiáng)度的表達(dá)情況。由圖 3.2（A）所示，與細(xì)胞在明場中的位置相比，能夠發(fā)出綠色熒光的外泌體存在于巨噬細(xì)胞內(nèi)部，并且在加入 2B4-exo 和 IE8-exo 后，巨噬細(xì)胞對 2B4-exo、IE8-exo 的吸收率在 24 h 內(nèi)會隨著時間的增加而增加，到 48 h 時則無明顯增加。圖 3.2（B）是根據(jù)巨噬細(xì)胞

20圖 3.2 巨噬細(xì)胞對外泌體的吸收情況 (A) 熒光顯微鏡下 2B4-exo 和 IE8-exo 加入到巨噬細(xì)胞后 4h，12h，24h，48h 的被吸收情況，綠色熒光顯示為外泌體已被巨噬細(xì)胞吸收；(B)根據(jù)不同時間外泌體被巨噬細(xì)胞吸收情況所做的統(tǒng)計圖3.3 PCa-exos 能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向 M2 亞型極化3.3.1 PCa-exos 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞 M2 型分子標(biāo)志 CD206 表達(dá)增高為了檢測 PCa-exos 是否能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向 M2 亞型極化，我們觀察 M2型巨噬細(xì)胞的特異性分子標(biāo)志CD206是否在PCa-exos誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞表面表達(dá)。我們將提出的 2B4-exo 和 IE8-exo 加入到巨噬細(xì)胞中培養(yǎng) 48 h 后，對細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，在普通顯微鏡和熒光顯微鏡下選取合適的視野拍照，，每組 3 個復(fù)孔，每孔 3 個視野，觀察并計算各組巨噬細(xì)胞表面 CD206 綠色熒光的表達(dá)情況。如圖 3.3.1（A）所示，M2、2B4-exo-Mφ 和 IE8-exo-Mφ 3 組巨噬細(xì)胞表面的 CD206綠色熒光表達(dá)強(qiáng)烈，M0、M1 組和無外泌體的對照組 2B4-GW4869、IE8-GW4869
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2706874