【摘要】：研究背景和目的腸道病毒71型(EV71)是手足口病的主要病原體之一,由EV71引起的手足口病大部分表現(xiàn)為輕微癥狀,但仍有部分患者的病情進(jìn)展為重癥神經(jīng)系統(tǒng)疾病,并引起腦干腦炎,急性弛緩性麻痹,肺水腫和心肺功能衰竭,有較高的病死率。由于目前沒有有效預(yù)防或治療EV71的藥物和疫苗,雖有進(jìn)入臨床試驗(yàn)的藥物或疫苗,但很難廣泛應(yīng)用于人群,仍需繼續(xù)對(duì)EV71感染的機(jī)制進(jìn)行深入研究以探索新的針對(duì)EV71的藥物靶點(diǎn)。細(xì)胞自噬(autophagy)是在真核生物中高度保守的過程,降解長(zhǎng)壽命蛋白及衰老細(xì)胞器以實(shí)現(xiàn)再循環(huán)利用,發(fā)生在細(xì)胞正常生長(zhǎng)發(fā)育、分化的生理過程中,病原體感染時(shí)也會(huì)引起自噬的發(fā)生。由于在免疫過程中的作用,自噬往往被病原體所利用以逃逸免疫,自噬體膜也可能被病原體重構(gòu)以利于其復(fù)制。相關(guān)研究通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明了EV71感染可誘導(dǎo)自噬并促進(jìn)EV71復(fù)制,但其具體分子機(jī)制仍未明確。EV71病毒的VP1蛋白位于病毒最外部的部分,能夠結(jié)合宿主細(xì)胞表面受體來(lái)協(xié)助病毒感染,具有重要的研究意義,VP1蛋白與宿主細(xì)胞蛋白存在復(fù)雜的相互作用。因此,本研究考慮VP1蛋白可能參與了 EV71誘導(dǎo)自噬的調(diào)控機(jī)制。故提出猜想:EV71病毒通過其VP1蛋白參與自噬的調(diào)控和執(zhí)行過程。研究方法1.EV71誘導(dǎo)的自噬的檢測(cè)采用Western Blot技術(shù),檢測(cè)自噬的生物標(biāo)志物L(fēng)C3的轉(zhuǎn)化;構(gòu)建RD-GFP-RFP-LC3細(xì)胞株,通過熒光顯微鏡對(duì)熒光自噬顆粒進(jìn)行檢測(cè)。使用qPCR技術(shù)檢測(cè)自噬抑制后的病毒含量,驗(yàn)證EV71病毒復(fù)制過程是否需要自噬。2.構(gòu)建EV71 VP1表達(dá)載體,探索VP1蛋白是否參與EV71誘導(dǎo)的自噬將VP1蛋白構(gòu)建于pEGFP-N1,在表達(dá)載體轉(zhuǎn)染后,采用qPCR技術(shù)檢測(cè)自噬相關(guān)的基因,采用Westem Blot技術(shù)檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白,驗(yàn)證EV71 VP1蛋白是否參與EV71誘導(dǎo)自噬的調(diào)控機(jī)制。3.篩選與VP1蛋白存在相互作用的自噬相關(guān)蛋白,并探索其在病毒復(fù)制中的作用聯(lián)合免疫共沉淀技術(shù)及質(zhì)譜技術(shù),篩選與EV71 VP1病毒存在相互作用的自噬相關(guān)蛋白;隨后設(shè)計(jì)合成相關(guān)蛋白的siRNA,沉默相關(guān)蛋白的表達(dá),采用qPCR技術(shù)檢測(cè)病毒的含量變化。結(jié)果1.RD-GFP-RFP-LC3細(xì)胞構(gòu)建成功,在EV71感染后可觀察到綠色和紅色的自噬熒光顆粒。Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示以MOI=1感染細(xì)胞,在感染后12、24、48h,LC3 Ⅱ的含量均高于對(duì)照組;在EV71感染48h后,自噬相關(guān)蛋白ATG4B、ATG5、ATG7的蛋白含量增加,而在加入自噬抑制劑3-MA后含量減少。2.qPCR檢測(cè)病毒含量顯示,應(yīng)用自噬抑制劑3-MA后,細(xì)胞內(nèi)病毒的復(fù)制在0h、6h、12h、24h分別減少3.9倍、48.7倍、18.1倍、9.3倍,24h上清病毒含量減少8.3倍(p0.05);應(yīng)用自噬抑制劑LY294002后,9h和12h的細(xì)胞內(nèi)病毒的含量減少3、2,2倍(p0.05)。3.構(gòu)建VP1表達(dá)載體,在表達(dá)載體轉(zhuǎn)染后,qPCR檢測(cè)顯示與對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染了pEGFP-N1-VP1后,ATG5在24h升高1.6倍,ATG7在24h時(shí)升高1.2倍(p0.05),Western Blot檢測(cè)顯示與對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照pEGFP-N1組相比,轉(zhuǎn)染了pEGFP-N1-VP1 24、48h后,LC3 Ⅱ蛋白量較對(duì)照組的明顯增加,而添加3-MA抑制自噬后,LC3 Ⅱ蛋白量相對(duì)減少。在轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-VP1 24h時(shí),自噬相關(guān)蛋白ATG4B、ATG5、ATG7的表達(dá)也較對(duì)照組增加,而添加3-MA抑制自噬后相對(duì)減少。4.構(gòu)建VP1分段表達(dá)載體,在表達(dá)載體轉(zhuǎn)染后,Western Blot檢測(cè)顯示和pEGFP-N1 相比,與pEGFP-N1-VP1一樣,pEGFP-N1-VP1(6)可以引起 LC3發(fā)生酯化,LC3 Ⅱ明顯增加。此外,ATG5的蛋白含量較pEGFP-N1、對(duì)照組增多。5.聯(lián)合免疫共沉淀技術(shù)及質(zhì)譜技術(shù),篩選出7個(gè)與VP1及VP1(6)均存在相互作用的蛋白,其中PHB2參與自噬。6.針對(duì)PHB2設(shè)計(jì)合成siRNA,轉(zhuǎn)染后感染病毒,qPCR檢測(cè)顯示與NC組相比,感染后12、24、48h細(xì)胞內(nèi)PHB2含量減少約77%、52%、82%(p0.05),細(xì)胞內(nèi)病毒RNA含量減少57.6%(p0.05)。結(jié)論1.EV71感染后可誘導(dǎo)自噬并促進(jìn)病毒復(fù)制。2.EV71病毒的VP1蛋白的尾部參與EV71病毒誘導(dǎo)自噬的過程。3.EV71 VP1蛋白能夠通過其與PHB2的相互作用,參與自噬的調(diào)控或執(zhí)行過程,促進(jìn)病毒自噬的復(fù)制。
【圖文】：

２．４實(shí)驗(yàn)結(jié)果逡逑２．４．１邐ＲＤ－ＧＦＰ－ＲＦＰ－ＬＣ３邋細(xì)胞構(gòu)建成功逡逑由圖２－１可見，在焚光顯微鏡下觀察，，可見廣泛存在的綠色熒光和紅色熒光，逡逑ＲＤ－ＧＦＰ－ＲＦＰ－ＬＣ３細(xì)胞構(gòu)建成功�？捎糜谧允傻臋z測(cè)。逡逑＿＿擺＇逡逑ＡＢＣ逡逑圖２－１ＲＤ－ＧＦＰ－ＲＦＰ－ＬＣ３細(xì)胞熒光表達(dá)情況圖（Ａ：白光鏡下，ｌＯＯｘＢ：綠色熒光鏡下，１０0ｘ逡逑Ｃ：紅色熒光鏡下，１０0ｘ邋）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－１邋Ｔｈｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ｇｒｅｅｎ邋ａｎｄ邋ｒｅｄ邋ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｏｆ邋ＲＤ－ＧＦＰ－ＲＦＰ－ＬＣ３邋（Ａ：邋ｕｎｄｅｒ逡逑ｔｈｅ邋ｗｈｉｔｅ邋ｌｉｇｈｔ，邋１０0ｘ邋Ｂ：邋ｕｎｄｅｒ邋ｔｈｅ邋ｇｒｅｅｎ邋ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ邋ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，邋１０0ｘ邋Ｃ：邋ｕｎｄｅｒ邋ｔｈｅ邋ｒｅｄ逡逑ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ邋ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，邋１００邋ｘ）逡逑２．４．２邐ＥＶ７１感染后可觀察到自噬逡逑ＲＤ－ＧＦＰ－ＲＦＰ－ＬＣ３細(xì)胞給予對(duì)照、饑餓、雷帕霉素（Ｒａｐａ邋４００邋ｎＭ）、３－ＭＡ逡逑（１０ｍＭ）、ＥＶ７１邋（ＭＯＩ＝ｌ）、ＥＶ７１邋（ＭＯＩ＝５）處理后的熒光圖片及邋ＩｍａｇｅＪ邋軟逡逑件融合后的圖片如圖２－２，圖２－３，圖２－４所示。逡逑圖２－２為處理后１２ｈ的細(xì)胞熒光圖。在１２ｈ時(shí)，對(duì)照組可見廣泛存在的雙熒逡逑光，但未見兩種熒光的熒光顆粒；饑餓組可見少量綠色和紅色熒光顆粒，融合后逡逑為黃色熒光顆粒；自噬激活劑雷帕霉素處理組可見少量綠色和紅色熒光顆粒

圖２－３不同處理組處理ＲＤ－ＧＦＰ－ＲＦＰ－ＬＣ３細(xì)胞２４ｈ的熒光圖（１０0ｘ）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－３邋Ｔｈｅ邋ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ邋ｏｆ邋ＲＤ－ＧＦＰ－ＲＦＰ－ＬＣ３邋ｃｅｌｌｓ邋２４ｈ邋ａｆｔｅｒ邋ｔｒｅａｔｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ逡逑（１０0ｘ）逡逑１６逡逑
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R373

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本文編號(hào)：2706777