【摘要】：本論文針對(duì)禽流感病毒(AIV)的關(guān)鍵基因--復(fù)制酶基因PB2,設(shè)計(jì)并構(gòu)建了八種M1GS核酶,分別是M1GS-T_(436)、M1GS-T_(934)、M1GS-T_(1105)、M1GS-T_(1523)、M1GS-T_(1771)、M1GS-C_(341)、M1GS-C_(1531)、M1GS-C_(1760)。通過體外切割實(shí)驗(yàn),檢測(cè)其對(duì)底物RNA的切割活性,結(jié)果顯示:M1GS-T_(436)、M1GS-T_(1105)、M1GS-T_(1523)、M1GS-C_(1531)和M1GS-C_(1760)這五種核酶均具有明顯的特異切割活性,核酶M1GS-C_(341)也具有較強(qiáng)的切割活性,但屬于非特異性切割,而核酶M1GS-T_(934)和M1GS-T_(1771)則無明顯的切割活性。進(jìn)一步通過體外切割產(chǎn)物電泳圖及各核酶相對(duì)活性表等一系列進(jìn)行分析,選擇活性較高的三種核酶M1GS-T_(1105)、M1GS-T_(1523)、M1GS-C_(1760)作為對(duì)象,分別構(gòu)建上述三種核酶的真核表達(dá)重組質(zhì)粒(M1GS/T_(1105)-PLXSN、M1GS/T_(1523)-PLXSN、M1GS/C_(1760)-PLXSN)以及PB2蛋白與綠色熒光蛋白融合表達(dá)的質(zhì)粒(PB2-EGFP),分別將這些M1GS真核表達(dá)重組質(zhì)粒與PB2-EGFP共轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞。Western Blot結(jié)果顯示,三種M1GS核酶均能顯著抑制蛋白PB2的表達(dá);掃描細(xì)胞的熒光強(qiáng)度后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染核酶M1GS-T_(1105)、M1GS-T_(1523)和M1GS-C_(1760)可大大降低綠色熒光的強(qiáng)度,抑制率分別為77.53±1.98%、58.84±0.86%和80.37±1.46%。本文為進(jìn)一步研究M1GS核酶的胞內(nèi)乃至動(dòng)物體內(nèi)的抗病毒效應(yīng)提供了良好的材料,并為抗AIV新型核酸類藥物的研究與開發(fā)奠定了一定的基礎(chǔ)。此外,本文亦提出了關(guān)于M1GS設(shè)計(jì)方面的一些觀點(diǎn),為M1GS核酶的相關(guān)研究提供了有益的參考。
【圖文】：

1.8 對(duì)轉(zhuǎn)化子快速鑒定與測(cè)序挑取疑似陽性菌菌落接種至含氨芐抗性的 5ml LB 液體培養(yǎng)基中，200rpm 37℃振蕩h，12,000rpm 離心 30s，棄上清。菌體處理后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，通過條帶比對(duì)初菌落質(zhì)粒的大小[25]。對(duì)陽性菌液抽提質(zhì)粒后 PCR 擴(kuò)增再次檢測(cè)并送去測(cè)序。2 人工 M1GS 核酶的設(shè)計(jì)與構(gòu)建2.1 人工 M1GS 的靶位確定采用計(jì)算機(jī)軟件 DNAMAN 和 RNAstructure 分析 AIV PB2 基因上 mRNA 的序列及征，搜尋切割靶位。大量文獻(xiàn)得出高效設(shè)計(jì)的 GS 有利于引導(dǎo) RNase P 對(duì)靶基因的切割[26，27]。再次參考大量文獻(xiàn)的研究成果，通過軟件 Genetool，對(duì)底物 PB2 基因進(jìn)行整個(gè)序列在的人工核酶 M1GS 作用靶區(qū)域。依照模式在 AIV 的 PB2 基因上共搜尋到 T1、T2、T3、T4、T5、C1、C2、C3 八點(diǎn)。如下所示（圖 1-1）：

13圖 1-4 PB2 基因小片段亞克隆示意圖亞克隆的引物設(shè)計(jì)亞克隆，引物設(shè)計(jì)如前。隆與篩選照前面所訴，，進(jìn)行亞克隆后的篩選并鑒定處理。分別將本次成功2-A/pGEM3z、 PB2-B/pGEM3z、PB2-C/pGEM3z。外轉(zhuǎn)錄10*轉(zhuǎn)錄緩沖液中的亞精胺沉淀，我們嚴(yán)格按以下順序依次加入，應(yīng)體系如下：
【學(xué)位授予單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R373

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2706678