發(fā)布時間：2020-06-09 23:48

【摘要】：目的:從體內(nèi)實驗及體外實驗中探討rAlb-34k2蛋白對鼠耳肥大細(xì)胞活化及對Raw264.7細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子、趨化因子的調(diào)控作用。方法:1)以Balb/c小鼠為實驗對象,以0.6%醋酸、滅活rAlb-34k2蛋白和rAalb-CTL2蛋白(原核重組表達(dá)的另一種白紋伊蚊唾液分泌性蛋白)為實驗對照,通過皮下注射rAlb-34k2蛋白(294.1pM),利用甲苯胺藍(lán)染色法檢測小鼠鼠耳肥大細(xì)胞脫顆粒率的變化;用ELISA法檢測小鼠鼠耳組織液中組胺釋放的變化。2)以小鼠巨噬細(xì)胞系Raw264.7細(xì)胞為實驗對象,以rAalb-CTL2蛋白為實驗對照,用不同濃度的rAlb-34k2蛋白(29.41pM/mL、294.1pM/mL)刺激Raw264.7細(xì)胞,利用qRT-PCR方法檢測刺激后6h和24h時Raw264.7細(xì)胞促炎細(xì)胞因子(IL-6、IL-1β、TNF-α)、抑炎細(xì)胞因子(IL-10)、中性粒細(xì)胞趨化因子(CXCL2)及單核細(xì)胞趨化因子(CCL2)mRNA水平的表達(dá)變化;利用ELISA方法檢測Raw264.7細(xì)胞培養(yǎng)上清中促炎細(xì)胞因子(IL-6、IL-1β)蛋白水平的表達(dá)變化。結(jié)果:1)肥大細(xì)胞脫顆粒率檢測結(jié)果:在rAlb-34k2蛋白(294.1pM)刺激小鼠鼠耳20分鐘時,各組肥大細(xì)胞脫顆粒率分別為:22.33%(陰性對照組)、49.00%(rAlb-34k2組)、49.75%(陽性對照組)、40.40%(rAalb-CTL2組)、41.25%(滅活rAlb-34k2組),rAlb-34k2組與陰性對照組間具有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.001);組胺釋放檢測結(jié)果:rAlb-34k2蛋白(294.1pM)刺激鼠耳20分鐘時,各組組胺釋放未檢測到明顯變化。2)細(xì)胞因子及趨化因子檢測結(jié)果:與正常細(xì)胞對照組相比,在蛋白干預(yù)Raw264.7細(xì)胞6h時,低濃度(29.41pM/mL)和高濃度(294.1pM/mL)的rAlb-34k2蛋白組均能上調(diào)細(xì)胞因子IL-6(上調(diào)倍數(shù)分別為41倍,P0.001和138倍,P0.001)、IL-1β(上調(diào)倍數(shù)分別為14倍,P0.001和31倍,P0.001)、TNF-α(上調(diào)倍數(shù)分別為2倍,P0.001和3倍,P0.001)、IL-10(上調(diào)倍數(shù)分別為2.3倍,P0.001和2.7倍,P0.001)的mRNA表達(dá),亦能上調(diào)趨化因子CXCL2(上調(diào)倍數(shù)分別為4.7倍,P0.001和10倍,P0.001)、CCL2(上調(diào)倍數(shù)分別為6倍,P0.001和9倍,P0.001)的mRNA表達(dá);24h時,低濃度的rAlb-34k2蛋白組均能上調(diào)細(xì)胞因子IL-6(上調(diào)倍數(shù)為187倍,P0.001)、IL-1β(上調(diào)倍數(shù)為26倍,P0.001)、TNF-α(上調(diào)倍數(shù)為2.2倍,P0.001)、IL-10(上調(diào)倍數(shù)為5.4倍,P0.001)的mRNA表達(dá),亦能上調(diào)趨化因子CXCL2(上調(diào)倍數(shù)為11倍,P0.001)、CCL2(上調(diào)倍數(shù)為15倍,P0.001)的mRNA表達(dá);此外,在時間動態(tài)上觀察(6h~24h),低濃度組的各因子(IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-10、CXCL2、CCL2)均表現(xiàn)出持續(xù)上升狀態(tài),而rAalb-CTL2對照組各因子無明顯變化;從蛋白水平來看,高濃度的rAlb-34k2蛋白(294.1pM/mL)具有促進(jìn)Raw264.7細(xì)胞表達(dá)IL-6和IL-1β的作用。結(jié)論:1)rAlb-34k2蛋白在體內(nèi)可活化小鼠鼠耳肥大細(xì)胞;2)rAlb-34k2蛋白在體外可促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞系Raw264.7細(xì)胞表達(dá)促炎細(xì)胞因子IL-6、IL-1β及趨化因子CXCL2、CCL2,且表現(xiàn)為蛋白劑量依賴型。這些結(jié)果提示rAlb-34k2蛋白具有促進(jìn)炎癥發(fā)生的作用,為探討白紋伊蚊唾液34k2蛋白的生物學(xué)功能補(bǔ)充了實驗依據(jù)。
【圖文】：

鼠耳組胺檢測結(jié)果上述結(jié)果可知，rAlb-34k2 蛋白具有促進(jìn)小鼠鼠耳肥大細(xì)胞脫顆粒的作部分實驗分別以 N.S 和 0.6%醋酸作為陰性和陽性對照，，選用雙抗體夾 方法檢測肥大細(xì)胞脫顆粒較為特異性的指標(biāo)組胺，觀察在 rAlb-34k2 作組胺的釋放情況。組胺標(biāo)準(zhǔn)品的濃度（ng/mL）為橫坐標(biāo)，OD450值為縱坐標(biāo)，建立三次方程（圖 3），組胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為 y=0.00173+ 0.11256x 0.000512x3，r2=0.99975，說明標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)性較高，可用于后續(xù)實驗。組胺果如圖 4 所示，N.S 組、0.6%醋酸組和 rAlb-34k2 蛋白組之間未出現(xiàn)明

16圖 4 rAlb-34k2 蛋白對小鼠鼠耳組胺釋放的影響Fig. 4 Effects of rAlb-34k2 protein on histamine release in mouse ear的基因的熔解曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線用各基因特異性引物，均可擴(kuò)增出與預(yù)期大小一致的目的基因（圖引物可有效擴(kuò)增。各基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖 6 所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及系數(shù)如表 2 所示，0.998< r2<0.9997，擴(kuò)增效率 90%< E <105%，說關(guān)性好，引物擴(kuò)增效率較高。熔解曲線如圖 7 所示，波峰單一、峰型特異性擴(kuò)增。
【學(xué)位授予單位】：貴州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R392

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7 宋航;田炎s

本文編號：2705443