【摘要】：目的:探討沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis,Ct.)pORF5質(zhì)粒蛋白能否通過上調(diào)宿主細(xì)胞NQO1的表達(dá)抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)及IL-6和IL-12的產(chǎn)生,為進(jìn)一步闡明pORF5質(zhì)粒蛋白在Ct的致病機(jī)制中的作用提供理論依據(jù)。方法:pGEX-6p-1/pORF5重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌E.coli XLl-blue接種至含Amp的LB固體平板,擴(kuò)大培養(yǎng)后經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)GST-pORF5融合蛋白,融合蛋白用Glutathione Sepharose 4B純化及PreScission Protease切除GST標(biāo)簽后得到pORF5質(zhì)粒蛋白,SDS-PAGE及Western blotting分析并鑒定GST-pORF5融合蛋白和pORF5質(zhì)粒蛋白。BCA法測定pORF5質(zhì)粒蛋白濃度,多粘菌素B處理去除內(nèi)毒素。以不同濃度(0、5、10、15 μg/mL)pORF5質(zhì)粒蛋白刺激HeLa細(xì)胞24 h及最佳濃度pORF5質(zhì)粒蛋白刺激HeLa細(xì)胞不同時(shí)間(0、6、12、18、24 h)后,RT-qPCR 檢測 HeLa 細(xì)胞 NQO1的mRNA轉(zhuǎn)錄水平,Western blotting檢測HeLa細(xì)胞NQO1的蛋白表達(dá)情況;收集不同濃度pORF5質(zhì)粒蛋白刺激HeLa細(xì)胞18 h的細(xì)胞或培養(yǎng)液上清,LPS刺激為陽性對照組,分別檢測丙二醛(MDA)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)及總抗氧化能力(T-AOC);10 μg/mL pORF5質(zhì)粒蛋白刺激感染Ct的HeLa細(xì)胞不同時(shí)間,并以相同時(shí)間點(diǎn)PBS處理感染衣原體的HeLa細(xì)胞作為對照,分別檢測MDA、T-SOD及T-AOC,間接免疫熒光法檢測包涵體形成;不同濃度pORF5質(zhì)粒蛋白刺激經(jīng)PMA處理的THP-1細(xì)胞24 h及最佳濃度pORF5質(zhì)粒蛋白刺激經(jīng)PMA處理的THP-1細(xì)胞不同時(shí)間,收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清,ELISA分別檢測IL-6和IL-12的水平。10 μg/mL pORF5質(zhì)粒蛋白刺激經(jīng)siRNA-NQO1干擾NQO1表達(dá)的HeLa細(xì)胞及未干擾的對照細(xì)胞18 h后,分別檢測MDA、T-SOD及T-AOC;15μg/mL pORF5質(zhì)粒蛋白刺激經(jīng)siRNA-NQO1干擾NQO1表達(dá)的THP-1細(xì)胞及未干擾的對照細(xì)胞18 h后,ELISA分別檢測IL-6和IL-12的水平。結(jié)果:1.pGEX-6p-1/pORF5重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)分子量約為54 kDa的GST-pORF5融合蛋白,融合蛋白經(jīng)純化及切除GST標(biāo)簽后得到分子量約為28 kDa的pORF5質(zhì)粒蛋白。2.不同濃度pORF5質(zhì)粒蛋白刺激HeLa細(xì)胞24h后,RT-qPCR及Western blotting結(jié)果顯示HeLa細(xì)胞中NQO1的mRNA水平及蛋白水平呈濃度依賴性上升,且在10 μg/mL時(shí)上調(diào)最明顯;以10μg/mL濃度的pORF5質(zhì)粒蛋白刺激HeLa細(xì)胞不同時(shí)間后Western blotting結(jié)果顯示當(dāng)刺激時(shí)間為18h,HeLa細(xì)胞中NQO1的蛋白水平上調(diào)最明顯。3.不同濃度pORF5質(zhì)粒蛋白刺激HeLa細(xì)胞18 h后,MDA、T-SOD及T-AOC檢測結(jié)果顯示:與LPS 陽性對照組相比,當(dāng)pORF5質(zhì)粒蛋白刺激濃度為10 μg/mL時(shí),MDA含量最少,為0.21±0.02 nmol/mg(P0.01),T-SOD 及 T-AOC 含量最高,分別為 48.79±1.83 U/mL(P0.01)和 50.76±0.94U/mL(P0.01)。4.10 μg/mL pORF5質(zhì)粒蛋白刺激感染Ct的HeLa細(xì)胞不同時(shí)間后,相比于PBS對照組,MDA檢測結(jié)果顯示在18h時(shí),MDA的減少程度最明顯,為1.35±0.04 nmo1/mg(P0.01):T-SOD和T-AOC檢測結(jié)果均顯示在18h時(shí),二者的升高程度最明顯,分別為26.61士2.21 U/mL(P0.01)和 34.40±2.50U/mL(P0.01)。間接免疫熒光結(jié)果顯示:對照組IFU為7.13 × 105/mL,pORF5刺激組IFU為9.03 X 105/mL,包涵體數(shù)量較對照組多26.7%(P0.05)。5.不同濃度pORF5質(zhì)粒蛋白刺激經(jīng)PMA預(yù)處理的THP-1細(xì)胞24 h后,ELISA結(jié)果顯示IL-6及IL-12的水平呈濃度依賴性減少且在濃度為15μg/mL時(shí),IL-6及IL-12的水平分別為3.83±0.37 pg/mL(P0.01)和 2.24±0.01pg/mL(P0.01);15 μg/mL pORF5 質(zhì)粒蛋白刺激經(jīng)PMA預(yù)處理后的THP-1細(xì)胞不同時(shí)間后,ELISA結(jié)果顯示IL-6及IL-12的水平呈時(shí)間依賴性減少且在刺激時(shí)間為18 h時(shí),IL-6及 IL-12 的水平分別為 2.07±0.55 pg/mL(P0.05)和 2.31±0.14 pg/mL(P0.01)。6.pORF5質(zhì)粒蛋白刺激干擾NQO1蛋白表達(dá)的HeLa細(xì)胞后,MDA、T-SOD和T-AOC檢測結(jié)果顯示:與未干擾的對照組相比,MDA 含量增加 0.92±0.27 pg/mL(P0.05),T-SOD 和 T-AOC 含量分別降低 21.90±3.36U/mL(P0.05)和 22.51±2.82U/mL(P0.01)。pORF5質(zhì)粒蛋白刺激干擾NQO1蛋白表達(dá)的THP-1細(xì)胞后,ELISA結(jié)果顯示:與未干擾的對照組相比,IL-6及IL-12的水平分別升高11.16±3.13pg/mL(P0.05)和6.91±0.32pg/mL(P0.01)。結(jié)論:沙眼衣原體pORF5質(zhì)粒蛋白通過上調(diào)宿主細(xì)胞NQO1蛋白的表達(dá)發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用并抑制IL-6及IL-12的產(chǎn)生。
【圖文】：

第 4 章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果白的表達(dá)、純化與鑒定合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)-1/pORF5 重組質(zhì)粒的 E.coli XL1-blue 大腸桿，，擴(kuò)大培養(yǎng)再用 IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，S上清在大約 54 kDa 位置處有明顯的粗蛋白條 融合蛋白分子量相符（圖 1）。kDa M 上清 沉淀

圖 2 切除標(biāo)簽后 pORF5 質(zhì)粒蛋白的 SDS-PAGE 分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of GST-tag removed pORF5 plasmid protein1-4: purified pORF5 plasmid proteinpORF5融合蛋白和pORF5質(zhì)粒蛋白的Western blott性 GST 一抗及羊抗兔 IgG 二抗孵育 GST-pORF5 融合蛋白，顯示在 54 kDa 位置處有明顯的一條帶（圖 3A）；以本課題性pORF5一抗及羊抗鼠IgG二抗孵育純化酶切后的pORF blotting 結(jié)果顯示在 28 kDa 位置處有明顯的一條帶（圖 3BB3 GST-pORF5 融合蛋白和 pORF5 質(zhì)粒蛋白的 Western blotting 鑒定28 kDa
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R374

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本文編號：2704687