【摘要】：背景與目的:A型核纖層蛋白(lamin A)是參與DNA復(fù)制、DNA損傷修復(fù)、基因表達(dá)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、端粒動(dòng)力學(xué)和維持染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的多功能重要蛋白質(zhì)。其磷酸化修飾是它在細(xì)胞核內(nèi)運(yùn)動(dòng)遷移,參與調(diào)節(jié)多種蛋白功能和啟動(dòng)細(xì)胞周期核膜溶解的重要基礎(chǔ)。然而目前對于lamin A的磷酸化功能調(diào)控知之甚少,并且lamin A上大多數(shù)磷酸化位點(diǎn)的功能重要性仍未有報(bào)道。目前已知LMNA基因G608G突變導(dǎo)致lamin A C-端缺失50個(gè)氨基酸,形成異常lamin A(progerin)在核內(nèi)堆積并引發(fā)細(xì)胞衰老。以往研究多關(guān)注于progerin對細(xì)胞毒性和胞核形態(tài)改變,而我們發(fā)現(xiàn)progerin缺失的50個(gè)氨基酸中存在多個(gè)磷酸化位點(diǎn),質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)有些位點(diǎn)屬于高轉(zhuǎn)化率位點(diǎn),提示它們發(fā)揮重要功能。我們研究的目的在于尋找這段lamin A C-末端缺失的關(guān)鍵磷酸化位點(diǎn)及其特異的磷酸激酶,探討位點(diǎn)磷酸化對于laminA核內(nèi)定位及細(xì)胞衰老通路的影響。方法:我們首先通過生物信息學(xué)方法篩選lamin A缺失肽段高轉(zhuǎn)換的磷酸化位點(diǎn),通過構(gòu)建位點(diǎn)突變質(zhì)粒進(jìn)行293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染,免疫沉淀分析lamin A特異位點(diǎn)磷酸化水平,發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵位點(diǎn)的突變顯著影響lamin A的整體磷酸化。然后我們制備了關(guān)鍵位點(diǎn)的磷酸化抗體,通過免疫共沉淀及體內(nèi)外激酶實(shí)驗(yàn),證實(shí)磷酸化關(guān)鍵位點(diǎn)的激酶。此外,我們通過慢病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建lamin A突變體細(xì)胞,并進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)、MTS實(shí)驗(yàn)、β-gal染色實(shí)驗(yàn)等,檢測磷酸化位點(diǎn)失活對lamin A核內(nèi)分布及細(xì)胞衰老的影響。結(jié)果:(1)本研究鑒定了lamin A的兩個(gè)重要磷酸化位點(diǎn)Ser628及Ser636,發(fā)現(xiàn)Ser628和Ser636位點(diǎn)的突變降低了laminA蛋白的整體磷酸化水平。(2)我們證實(shí)了糖原合酶激酶3β(GSK3β)與lamin A存在相互作用并磷酸化lamin A Ser628位點(diǎn)。(3)同時(shí)發(fā)現(xiàn)酪蛋白激酶II(CK2)磷酸化lamin A Ser636位點(diǎn),并通過此位點(diǎn)的激活參與調(diào)控GSK3β對lamin A的磷酸化作用。(4)我們通過慢病毒感染構(gòu)建Ser628和Ser636點(diǎn)突變細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)位點(diǎn)磷酸化失活影響lamin A核內(nèi)分布。(5)Ser628、Ser636位點(diǎn)失活影響細(xì)胞增殖并且導(dǎo)致細(xì)胞衰老。(6)誘導(dǎo)損傷后,點(diǎn)突變細(xì)胞DNA損傷應(yīng)答明顯降低。結(jié)論:我們的研究結(jié)果證明GSK3β及CK2共同介導(dǎo)lamin A C-末端Ser628、Ser636位點(diǎn)磷酸化的激活,這兩個(gè)位點(diǎn)的磷酸化缺失影響lamin A核內(nèi)分布并導(dǎo)致細(xì)胞衰老。這些結(jié)果提示lamin A C-末端位點(diǎn)磷酸化參與細(xì)胞衰老通路的調(diào)控,通過小分子藥物提高或改善其磷酸化水平有可能為延緩細(xì)胞衰老提供新的治療思路。
【圖文】：

圖 1：LaminA 基本結(jié)構(gòu)組成（Kochin V et al. J Cell Sci 2014.）1.2 Lamin A 基因突變與疾病過去十幾年的研究表明，編碼核纖層蛋白的基因突變，特別是編碼 A 型核纖層蛋白

1.2 Lamin A 基因突變與疾病過去十幾年的研究表明，編碼核纖層蛋白的基因突變，特別是編碼 A 型核纖層蛋白的LMNA突變會(huì)引起各種各樣的疾病，通常統(tǒng)稱為核纖層蛋白病(laminopathies)(如圖2)。其臨床癥狀包括骨骼和心臟肌肉萎縮、脂肪代謝障礙、發(fā)育異常、皮膚病、神經(jīng)病變、腦白質(zhì)營養(yǎng)不良和加速老化[13]。根據(jù)它們影響的組織，可將病變大致分為四類。第一類影響肌肉細(xì)胞，包括 Emery-Dreifuss 肌營養(yǎng)不良癥（EDMD），B 型肢體帶狀肌營養(yǎng)不良癥（LGMD），LMNA 相關(guān)先天性肌營養(yǎng)不良癥（LCMD）和擴(kuò)張型心肌病伴傳導(dǎo)疾病（DCM-CD）。第二類是代謝性疾病，，包括由 LMNB1 突變引起的 Dunnigan 型家族性部分性脂肪代謝障礙（FPLD）和腦白質(zhì)營養(yǎng)不良，以及與 LMNA 突變密切相關(guān)的代謝綜合征（MS）[14,15]。第三類包括外周神經(jīng)元疾病 Charcot-Marie-Tooth（AD-CMT）。最后一類疾病影響多種組織并且與早期衰老有關(guān)。包括 Hutchinson-Gilford 早衰綜合征（HGPS），非典型 HGPS，非典型Werner 綜合征和下頜骨發(fā)育異常[16]。其中多半致病突變是錯(cuò)義突變
【學(xué)位授予單位】：深圳大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R329.2

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本文編號(hào)：2702447