發(fā)布時間：2020-06-07 17:06

【摘要】：人胚胎干細胞(Human Embryonic Stem Cells,hESCs)是分離自人囊胚的內細胞團,具有自我更新和多向分化的潛能[1]。hESCs生長在滅活的小鼠成纖維細胞(即飼養(yǎng)層)上,培養(yǎng)基里需要添加血清替代物(Knockout Serum Reβlacement,KSR)和多種細胞因子(如ActivinA和bFGF等),但是在此條件下培養(yǎng)的hESCs生長速度十分的緩慢,不能耐受單細胞消化,容易凋亡[2]。雖然市場上出現了商品化的Matrigel可以部分的替代飼養(yǎng)層細胞,但是培養(yǎng)在Matrigel上的hESCs同樣存在易分化和易凋亡等缺點,而且Matrigel操作麻煩,價格也相對比較的高。因此,尋找hESCs的新的培養(yǎng)方法已成為當前再生醫(yī)學的熱點研究方向之一。我們前期研究發(fā)現Wnt/β-catenin信號通路的小分子抑制劑IWR1可以改善目前hESCs培養(yǎng)的狀況。IWR1是Tankyrases的一個抑制劑,Tankyrases的功能主要就是促進Axin蛋白的降解,Axin蛋白是β-catenin降解復合物的主要組成成分,所以小分子IWR1處理過的細胞可以穩(wěn)定Axin蛋白從而降解β-catenin。雖然抑制Wnt/β-catenin信號通路可以促進hESCs的自我更新[3],但是具體的作用機制還不清楚。所以就得到了我所研究的課題:探究IWR1維持hESCs自我更新的分子機制。因為抑制Wnt/β-catenin信號通路可以促進hESCs的自我更新,所以我們就利用逆向思維來研究W nt/β-catenin信號通路是如何促進了hESCs分化,從而解析出IWR1維持hESCs自我更新的分子機制。本課題主要分為以下幾個部分:第一部分:以前的文獻報道過,β-catenin的過表達快速導致hESC分化[4]。因此,我們要首先需要確定β-catenin的這一功能。用PiggyBac載體(PB-Ctnnb1)使Ctnnb1在hESCs細胞株中的表達量提高。其中Ctnnb1在密碼子33處含有激活突變(S33Y:即當33位的絲氨酸(S)突變成酪氨酸(Y),導致β-catenin不能被磷酸化降解,從而穩(wěn)定其在細胞內的含量)。在添加了ActivinA/bFGFF/IWR1的培養(yǎng)基中培養(yǎng)6天之后,PB-Ctnnb1S33Y細胞中與分化相關的基因Cxcr4,FoxA 和Mixl1的表達含量顯著升高,然而轉有空載PB的對照細胞仍保留傳統的hESCs形態(tài),處于自我更新的狀態(tài)。比如具有堿性磷酸酶染色的活性,高表達與多能性相關的基因Oct4,Nanog和TRA1-81。這些結果表明Ctnnb1的過表達不利于hESCs的自我更新。因此,我們確定Ctnnb1的過表達能夠促進hESCs分化。第二部分:為了驗證Ctnnb1是否通過其轉錄活性誘導hESCs分化,基于Ctnnb1S33Y基因的特定結構域,設計了一系列的缺失突變體[5-6]。Ctnnb1蛋白由781個氨基酸組成,基于此,我們做了以下幾個突變體:Ctnnb1S33Y/△N48-217:Ctnnb1蛋白缺失N端第48到217的氨基酸,Ctnnb1S33Y/△N218-467:Ctnnb1蛋白缺失N端第218到467的氨基酸,Ctnnb1S33Y/△C468:Ctnnb1蛋白缺失C端第468到781的氨基酸,Ctnnb1S33Y/△C694:Ctnnb1蛋白缺失C端第694到781的氨基酸。將這些突變體形式的Ctnnb1插入PB質粒中并在hESCs中成功過表達。將其在添加了Activin/bFGF/IWR1的培養(yǎng)基中傳代2次之后,進行了一系列的功能性驗證后發(fā)現Cnnb1S33Y和Ctnnb1S33Y/△N48-217誘導hESCs分化。PB和Ctnnb1S33Y/△N218-467細胞中大多數hESCs仍然保持多能性。TOPFlash報告基因活性的結果顯示,Ctnnb1S33Y和Ctnnb1S33Y/△N48-217強烈激活TCF依賴性轉錄,但是S33Y突變對TCF轉錄的影響在很大程度上由于某些Ctnnb1結構域的缺失而消除,例如C末端(S33Y/△C468和C694)或armadillo repeats 3-8(S33Y/△N218-467)。因此,我們的數據與之前的模型一致,其中Ctnnb1通過armadillo repeats 3-8與TCF結合并通過其C-末端激活轉錄[33],并且還表明Ctnnb1主要通過與LEF1/TCF家庭成員相互作用誘導hESCs分化。第三部分:LEF1/TCF家族轉錄因子含有四個旁系同源物(LEF1,TCF1,TCF3和TCF4),并且都能夠與Ctnnb1相互作用[7]。為了確定Ctnnb1主要與LEF1/TCF家族中哪個基因相互作用誘導hESCs分化。我們在hESCs中分別過表達TCF因子,發(fā)現只有Tcf1過表達會導致hESCs明顯的分化。與PB對照細胞相比,Tcf1過表達的hESCs細胞變得扁平,失去活性并且多能性基因Oct4和Nanog的表達水平較低,同時顯示分化基因的表達增強,例如內胚層(Gata4和Gata6),中胚層(T和Mixl1)和外胚層(Fgf5)等標志基因。與此一致,免疫熒光染色顯示大多數過表達Tcf1基因的細胞中GATA6表達呈陽性。這些結果表明Ctnnb1主要通過與Tcf1相互作用誘導hESCs分化。最后,為了確定Tcf1誘導hESCs分化的機制,我們對PB和PB-TCF1的hESCs進行了RNA-Seq分析來評估基因的表達模式。結果顯示GATA6的表達顯著升高。所以我們在過表達TCF1的細胞株中敲低Gata6了轉錄本,經過免疫熒光染色及qRT-PCR分析結果顯示:與僅過表達TCF1的對照組細胞相比,過表達TCF1且同時敲低Gata6基因的hESCs中高表達自我更新標志基因Oct4和Nanog,而低表達分化基因Gata4,Gata6,FoxA2。這些結果表明GATA6可以調控Tcf1在hESCs中的功能。綜上所述,本課題通過逆向思維,研究Wnt/β-catenin信號通路促進hESCs分化,進而解析了IWR1抑制Wnt/β-catenin信號通路維持人胚胎干細胞自我更新的分子機制,即IWR1抑制Wnt/β-catenin信號通路后,阻止了β-catenin與TCF1的相互作用,從而抑制了分化基因Gata6的表達,從而維持hESCs在未分化狀態(tài)。研究結果擴大了人們對hESCs自我更新調控網絡的認識。
【圖文】：

圖１．２邋Ｃｔｎｎｂｉ敲低的ｈＥＳＣｓ能夠維持未分化狀態(tài)逡逑（Ａ）邐ｑＲＴ－ＰＣＲ分析在添加ＡｃｔｉｖｉｎＡ，邋ｂｌ＾ＧＦ和ＩＷＲ１的基礎培養(yǎng)基中培養(yǎng)７ｗ＾／ｓｈＲＮＡｈＥＳＣｓ中ｈＥＳＣｓ多能性標志物（（９ｃ／？＾和」＼＾／７0尺）表達。相對于逡逑ｍｂｌｅ邋ｓｈＲＮＡ，邋＊＊ｐ邋＜０．０１。逡逑

ＱｗｊＷ邋ｋｏ邋ｈＥＳＣｓ在長期培養(yǎng)一段時間后，仍然保留了典型的未分化ＥＳＣ逡逑形態(tài)，并且經過免疫熒光染色（ＩＦ）后，多能性基因ＯＣ７Ｖ表達染色呈陽性（圖逡逑１．３Ｃ），此結果，與敲低的細胞株結果類似（圖１．２Ａ和Ｂ）�？傊@些逡逑結果表明敲除的ｈＥＳＣｓ能夠維持未分化狀態(tài)。逡逑Ａ邐Ｂ逡逑Ｃｔｎｎｂｌ邋ＣＤＳ邋ｆｒｏｍ邋６１邋ｔｏ邋７８ｂｐ邐ｃｔｎｎｂｉ邋ｗｔ邋ｋｏ逡逑Ｗｉｌｄ邋Ｔｙｐｅ：邋ＣＴ邋ＧＴＴＡＧ邋ＴＣＡＣＴ邋ＧＧＣＡＧＣ邐ＣＴＮＮＢ１逡逑Ｋｎｏｃ＾ＣＴＧＴＴＡＧ＾ＣＡＣＴＧＧＣＡＧＣ邐0側一壽逡逑Ｃ邐ＣＴＮＮＢ１１邋０ＣＴ４邋Ｈｏｅｃｈｓｔ邋ＣＴＮＮＢＩ／Ｈｏｅｃｈｓｔ逡逑｜~|媝■曑逡逑畫■■■■逡逑圖１．３邋Ｃｔｎｎｂｌ敲除的ｈＥＳＣｓ能夠維持未分化狀態(tài)逡逑（Ａ邋，邋Ｂ邋）通過ＨＥＳ２邋ＥＳＣ中的基因組ＤＮＡ測序和蛋白質印跡分析驗證逡逑ＣＲ１ＳＰＲ／Ｃａｓ９對Ｃ融Ｗ的敲除。逡逑（Ｃ）在邋ｍＴｅＳＲ邋中培養(yǎng)邋１０邋代的邋Ｃ／ｗｊＷ－？Ｍ／／ｈＥＳＣｓ邋中的邋ＣＴＡＷ５／邋和邋ＯＣ７Ｖ邋的免逡逑疫染色。ＰＢ：邋ＰｉｇｇｙＢａｃ，邋ＣＶｗ？Ａ／：邋ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ，邋ＷＴ：野生型。數據代表三個生物逡逑重復的平均值±ｓ．ｄ。比例尺，，１００ｐｍ。逡逑３．２邐需要其轉錄活性來誘導ｈＥＳＣｓ分化逡逑３．２．１邋ＣＹ＂／}?／突變體過表達的ｈＥＳＣｓ細胞株的建立逡逑為了驗證是否通過其轉錄活性誘導ｈＥＳＣｓ分化，基于’基逡逑因的特定結構域，設計了一系列的缺失突變體｜５，６１邋（圖２．１Ａ）。７８１個氨基酸組逡逑成的Ｃ／Ｗ７／）／蛋白是重要的轉錄反式激活因子［７］�；诖�
【學位授予單位】：安徽大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R321

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本文編號：2701734