【摘要】：目的:髓樣抑制細(xì)胞(myeloid derived suppressor cells,MDSCs)是指髓系來源的、未成熟的、對(duì)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答具有抑制作用的一群異質(zhì)細(xì)胞。MDSCs細(xì)胞可抑制機(jī)體免疫細(xì)胞發(fā)揮正常固有性免疫和特異性免疫,使免疫細(xì)胞處于無應(yīng)答或者耐受狀態(tài)而不能及時(shí)清除變異的癌前細(xì)胞,失去殺傷腫瘤細(xì)胞的能力。MDSCs細(xì)胞還通過非免疫機(jī)制如促進(jìn)腫瘤新生血管形成、腫瘤細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移,參與調(diào)節(jié)腫瘤的生物學(xué)行為。MDSCs細(xì)胞對(duì)于腫瘤及其他疾病的負(fù)向調(diào)節(jié)作用得到了越來越多的重視,調(diào)控MDSCs細(xì)胞及其免疫抑制功能可能是一種潛在的癌癥治療方法。蛋氨酸腦啡肽(Methionine enkephalin,MENK)是一種由五個(gè)氨基酸殘基組成的內(nèi)源性阿片肽,具有自分泌旁分泌特點(diǎn),廣泛存在于神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)。MENK具有顯著的免疫調(diào)節(jié)作用及抗腫瘤作用。通過調(diào)控阿片受體表達(dá)與阿片受體結(jié)合,MENK可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期阻滯,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,對(duì)多種腫瘤如黑色素瘤,腦膠質(zhì)瘤,肺癌及胃癌等產(chǎn)生抗腫瘤作用。MENK也可以通過對(duì)免疫系統(tǒng)細(xì)胞產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)作用,直接增強(qiáng)免疫系統(tǒng)細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用或改變腫瘤微環(huán)境進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用。我們前期對(duì)MENK的免疫調(diào)節(jié)作用進(jìn)行了系統(tǒng)研究,證實(shí)了MENK對(duì)T細(xì)胞,巨噬細(xì)胞,NK細(xì)胞及DC細(xì)胞均有調(diào)節(jié)作用,但是MENK對(duì)于MDSCs細(xì)胞的調(diào)控作用及機(jī)制尚未明確,需進(jìn)一步論證。我們通過MENK作用于荷瘤小鼠脾臟及骨髓MDSCs細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)及MENK作用于s180肉瘤荷瘤小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的研究,探討MENK對(duì)MDSCs細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能及作用機(jī)制,完善MENK免疫調(diào)節(jié)作用網(wǎng)絡(luò)。實(shí)驗(yàn)方法:本研究分別通過體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探討MENK對(duì)荷瘤小鼠MDSCs細(xì)胞的調(diào)控作用。體外實(shí)驗(yàn)中采用8-10周雌性C57BL/6J小鼠,通過雙側(cè)腋皮下注射腹水瘤細(xì)胞建立荷瘤小鼠模型,應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)荷瘤小鼠與正常小鼠各器官中MDSCs細(xì)胞分布情況;免疫磁珠陽性分選荷瘤小鼠脾臟及骨髓的髓樣抑制細(xì)胞,體外培養(yǎng)并分別給予不同劑量MENK刺激,應(yīng)用CCK8法檢測(cè)MDSCs細(xì)胞增殖及活性,確定體外實(shí)驗(yàn)最佳濃度;分別采用MENK及MENK聯(lián)合阿片受體阻斷劑納曲酮(Naltrexone,NTX)刺激體外培養(yǎng)的骨髓及脾臟來源的MDSCs細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究:應(yīng)用流式細(xì)胞分析技術(shù)分別檢測(cè)各組MDSCs細(xì)胞中ROS含量,應(yīng)用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)MDSCs細(xì)胞μ和δ阿片受體mRNA表達(dá)水平,應(yīng)用ELISA法檢測(cè)MDSCs細(xì)胞上清分泌細(xì)胞因子IL-1β,IL-4,IL-6,IL-10及TGF-β1水平。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中建立與體外實(shí)驗(yàn)相同的荷瘤小鼠模型,經(jīng)MENK或MENK聯(lián)合NTX連續(xù)腹腔注射治療14天后,檢測(cè)荷瘤小鼠腫瘤體積、重量變化;伊紅-蘇木精染色觀察腫瘤組織形態(tài)學(xué)變化;免疫組織化學(xué)法分別檢測(cè)腫瘤組織中CD11b+細(xì)胞及Gr-1+細(xì)胞表達(dá)情況;ELISA法檢測(cè)小鼠血清中細(xì)胞因子IL-1β,IL-4,IL-6,IL-10及TGF-β1變化;免疫磁珠陽性分選治療后的荷瘤小鼠MDSCs細(xì)胞,應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)荷瘤小鼠脾臟和骨髓MDSCs細(xì)胞及其亞群比例變化;RT-qPCR法檢測(cè)MDSCs細(xì)胞阿片受體MOR和DOR基因表達(dá)水平,檢測(cè)MDSCs細(xì)胞免疫抑制功能相關(guān)分子Arg-1、iNOS的mRNA表達(dá)水平,檢測(cè)MDSCs細(xì)胞中基因Ets-1,sted1b的mRNA表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1、與正常小鼠相比,荷瘤小鼠免疫器官中MDSCs細(xì)胞含量及比例增加。流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示正常小鼠脾臟和外周血MDSCs細(xì)胞含量及比例低于荷瘤小鼠(P0.01),荷瘤小鼠器官中MDSCs細(xì)胞所占比例由高至低依次為:骨髓、外周血、腫瘤組織、脾臟、淋巴結(jié)和胸腺。2、經(jīng)免疫磁珠陽性分選總體MDSCs細(xì)胞及其亞群細(xì)胞純度均顯著提高,脾臟來源MDSCs細(xì)胞純度80%,骨髓來源MDSCs細(xì)胞純度90%。3、MENK對(duì)體外培養(yǎng)MDSCs細(xì)胞增殖的抑制作用呈劑量依賴性,最佳濃度為1.25mg/ml。4、與對(duì)照組相比MENK降低脾臟來源MDSCs細(xì)胞中ROS的含量(P0.05),骨髓來源MDSCs細(xì)胞中ROS含量呈下降趨勢(shì)。5、與對(duì)照組相比MENK上調(diào)MDSCs細(xì)胞MOR和DOR基因表達(dá)水平(P0.01),NTX可阻斷此效應(yīng)。6、MENK促進(jìn)脾臟來源MDSCs細(xì)胞分泌IL-4(P0.05),促進(jìn)骨髓來源MDSCs分泌IL-6(P0.05),其他細(xì)胞因子未表現(xiàn)出顯著變化。7、經(jīng)MENK腹腔注射治療后,荷瘤小鼠腫瘤及體積均顯著降低(P0.05),H-E染色結(jié)果顯示與對(duì)照組相比MENK組在腫瘤組織交界處淋巴細(xì)胞侵潤(rùn)明顯增加增加;免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示荷瘤小鼠腫瘤組織中,經(jīng)MENK治療后Gr-1陽性細(xì)胞與其他兩組相比減少,CD11b陽性細(xì)胞在三組間無明顯變化。8、ELISA結(jié)果顯示經(jīng)MENK治療后荷瘤小鼠血清中TGF-β1下降,IL-4、IL-6及IL-10含量增加(P0.05)。9、MENK顯著下調(diào)荷瘤小鼠脾臟中總體MDSCs細(xì)胞比例(P0.05),降低PMN-MDSCs比例(P0.01),增加M-MDSCs比例(P0.05),骨髓中MDSCs細(xì)胞及其兩個(gè)亞群所占比例均呈下降趨勢(shì)。10、MENK提高M(jìn)DSCs細(xì)胞中Arg-1基因表達(dá)水平,下降iNOS基因表達(dá)水平(P0.05);MENK下調(diào)MDSCs細(xì)胞中setd1b及Ets-1基因表達(dá)水平(P0.01)。11、MENK體內(nèi)治療上調(diào)MDSCs細(xì)胞MOR和DOR基因表達(dá)水平(P0.01),在脾臟中NTX可完全阻斷這種作用(P0.01)。結(jié)論:1、腫瘤發(fā)生環(huán)境中,小鼠各免疫器官中MDSCs細(xì)胞增多。2、MENK對(duì)荷瘤小鼠MDSCs細(xì)胞具有負(fù)向調(diào)節(jié)作用,抑制MDSCs細(xì)胞增殖,降低荷瘤小鼠脾臟及骨髓中MDSCs細(xì)胞比例,削弱MDSCs細(xì)胞的免疫抑制功能同時(shí)抑制腫瘤增長(zhǎng)。3、MENK對(duì)MDSCs細(xì)胞兩個(gè)主要亞群的具有不同調(diào)節(jié)作用,MENK主要通過降低荷瘤小鼠脾臟中PMN-MDSCs亞群比例,降低總體MDSCs細(xì)胞比例。4、MENK可能通過MDSCs細(xì)胞中μ和δ阿片受體結(jié)合,影響MDSCs細(xì)胞中Ets-1及setd1b基因表達(dá),干擾MDSCs細(xì)胞的免疫抑制功能。
【圖文】：

MDSCs 在荷瘤小鼠中樞及外周免疫器官中分測(cè)荷瘤小鼠骨髓、淋巴、腫瘤組織、外周血各器官 MDSCs 分布比例的統(tǒng)計(jì)分析，，MDSC瘤組織、脾臟及淋巴結(jié)，在胸腺中含量最低

圖 2 MDSCs 在正常小鼠脾臟和外周血中分布比例細(xì)胞術(shù)檢測(cè)正常小鼠外周血及脾臟中 MDSCs 分布比例；B:代SCs 所占比例統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示正常小鼠脾臟中 MDSCs 的含量。珠分選純化荷瘤小鼠脾臟和骨髓 MDSCs 結(jié)果磁珠 2 次陽性分選，分別從 C57BL/6J 荷瘤小鼠的脾細(xì)s。流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)純化前后的 MDSCs 細(xì)胞比例小鼠脾臟中總體 CD11b+Gr-1+細(xì)胞比例為（9.85±1.76ighly6-Clow細(xì)胞純度為（16.45±2.35）%，亞群 CD11b+24.20±1.0）%；純化后，總體 CD11b+Gr-1+細(xì)胞比例為（y6-Ghighly6-Clow細(xì)胞純度高達(dá)（80.2±3.0）%，亞群 CD11
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2698768