【摘要】：腸道病毒71型(enterovirus 71,EV-A71或EV71)和柯薩奇病毒A組16型(coxsakievirus A 16,CV-A16或CA16)[1]是手足口病的主要病原,二者可引起相似臨床癥狀,但感染機(jī)制的差異使CV-A16疫苗研究遲遲落后于EV-A71。因此,深入探索這兩種病毒與宿主免疫系統(tǒng)的相關(guān)性,仍具有重要的理論及應(yīng)用意義。前期研究證明,EV-A71和CV-A16均可通過呼吸道感染人體,而呼吸道上皮細(xì)胞的胞內(nèi)外均具有系統(tǒng)的模式識別受體(pattern recognition receptor PRR[1]),這些PRR對各類病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern PAMP[1])均具有識別的能力[2],從而啟動天然免疫反應(yīng)相關(guān)信號分子的表達(dá)調(diào)控程序。迄今為止,對腸道病毒與支氣管上皮細(xì)胞間的相互作用及其對天然免疫反應(yīng)信號變化趨勢的影響仍尚未明確。因此,本研究設(shè)計了作為腸道病毒主要抗原的VP1蛋白在支氣管上皮細(xì)胞16HBE中的單獨表達(dá)體系,來探究其對天然免疫相關(guān)信號分子的表達(dá)及T細(xì)胞免疫反應(yīng)的影響[2]。首先擴(kuò)增EV-A71和CV-A16的VP1序列,分別插入至載體pcDNA3.1(+),構(gòu)建重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-EV-A71-VP1和pcDNA-CV-A16-VP1。經(jīng)雙酶切及測序鑒定,兩種重組質(zhì)粒均正確構(gòu)建,并且經(jīng)Wester blot檢測VP1蛋白均表達(dá)正確。然后分別轉(zhuǎn)染人支氣管上皮細(xì)胞16HBE,于轉(zhuǎn)染后24、48和72 h收集樣本,實時定量PCR法檢測16HBE細(xì)胞中天然免疫反應(yīng)相關(guān)信號分子的表達(dá)情況[2]。結(jié)果表明:一方面,EV-A71-VP1和CV-A16-VP1兩個實驗組的信號分子表達(dá)譜在時間和數(shù)量上呈現(xiàn)截然不同的特點。轉(zhuǎn)染后24h到72h,EV-A71-VP1實驗組的表達(dá)量呈現(xiàn)出跳躍式的起伏,特別是 IFN-β、OX40L、IFN-a、IFN-γ、RANKL、IL-2,在 24h 時相較于基線對照均處于10倍至350倍的高位,而48h則劇烈降至10倍以下的水平。但CV-A16-VP1實驗組的表達(dá)量則在時間上趨于穩(wěn)定,而且數(shù)量上始終處于10倍以下的水平。另一方面,我們發(fā)現(xiàn)CV-A16-VP1實驗組上調(diào)而EV-A71-VP1實驗組下調(diào)的信號分子基本是發(fā)揮抗炎作用的因子,如IL-4、IL-13、GITRL;相反的,CV-A16-VP1實驗組下調(diào)、EV-A71-VP1實驗組上調(diào)的信號分子則基本是促炎因子。因此,結(jié)果表明EV-A71的VP1在一定程度上啟動了機(jī)體的天然免疫反應(yīng),而CV-A16的VP1效果卻不明顯。最后,為評價以上天然免疫相關(guān)信號分子的綜合效應(yīng),本實驗進(jìn)行了人IFN-γ特異性Elispot實驗,發(fā)現(xiàn)兩個病毒實驗組的結(jié)果具有相似性,即T細(xì)胞都發(fā)生了顯著的非特異性增殖;但經(jīng)DC細(xì)胞遞呈后的T細(xì)胞卻都沒有顯著的特異性增殖。綜上所述,腸道病毒EV-A71和CV-A16的VP1蛋白在16HBE中分別表達(dá)后,細(xì)胞中天然免疫相關(guān)信號分子的表達(dá)情況具有差異性[2];但對T細(xì)胞非特異性增殖和特異性增殖的作用具有相似性。因此,本實驗為進(jìn)一步探討不同腸道病毒早期通過呼吸道感染機(jī)體的機(jī)制提供了實驗依據(jù)。
【圖文】：

圖１腸道病毒的胞內(nèi)增殖過程逡逑３．天然免疫的分子機(jī)制逡逑在２０世紀(jì)６０年代到９０年代，獲得性免疫應(yīng)答主導(dǎo)了免疫生物學(xué)，直到一位逡逑致力于Ｔ細(xì)胞免疫學(xué)研宄的學(xué)者——察爾斯？簡威（Ｃｈａｒｌｅｓ邋Ｊａｎｅｗａｙ）邋［１８］在１９８９逡逑年發(fā)表了一篇文章，指出人們普遍低估了先天免疫系統(tǒng)的作用［１９］。他首次提出了抗逡逑原呈遞細(xì)胞上存在模式識別受體（ｐａｔｔｅｒｎ邋ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ邋ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，邋ＰＲＲ－２°＿），，其逡逑是一種可以感知病原體的化學(xué)產(chǎn)物的特定基序［２１］，然后指導(dǎo)Ｔ細(xì)胞去執(zhí)行不同功能。逡逑這個新的假說紛紛遭到質(zhì)疑，但十多年后，法國生物化學(xué)家朱爾斯？霍夫曼（Ｊｕｌｅｓ逡逑Ｈｏｆｆｍａｎｎ）的昆蟲的Ｔｏｌｌ受體、美國遺傳學(xué)家布魯斯？比托勒（Ｂｒｕｃｅ邋Ｂｅｕｔｌｅｒ）逡逑的哺乳動物中的研究則有力的證明了該假說的成立［２２’２３］。因此，他倆聯(lián)合獲得２０１１逡逑年諾貝爾獎。其實，ＰＡＭＰ和ＤＡＭＰ在多大程度上通過非自身或自身信號來誘導(dǎo)獲得逡逑性免疫反應(yīng)來影響免疫耐受仍然是一個有爭議的討論問題［２４’２５］。早在２０世紀(jì)７０逡逑年代，美國洛克菲勒大學(xué)的加拿大免疫學(xué)家（Ｒａｌｐｈ邋Ｓｔｅｉｎｍａｎ）邋［２１］就開始研究該概逡逑念中的關(guān)鍵參與者：樹突狀細(xì)胞Ｍ。他證明了樹突細(xì)胞是比巨噬細(xì)胞更有效的抗原逡逑呈遞細(xì)胞，并且它們是Ｔ細(xì)胞的主要指導(dǎo)者。所以斯坦曼成為了第三位獲得２０１１逡逑

的免疫應(yīng)答的激活。那么激活了天然免疫之后呢？邋Ｋａｕｆｍａｒｍ等人制作了一個天然免逡逑疫與適應(yīng)性免疫的聯(lián)系思維導(dǎo)圖，將關(guān)鍵節(jié)點羅列出來，可以讓我們更好的有一個逡逑框架式的理解，如
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R392

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本文編號：2697781