【摘要】：腸道病毒71型(enterovirus 71,EV-A71或EV71)和柯薩奇病毒A組16型(coxsakievirus A 16,CV-A16或CA16)[1]是手足口病的主要病原,二者可引起相似臨床癥狀,但感染機制的差異使CV-A16疫苗研究遲遲落后于EV-A71。因此,深入探索這兩種病毒與宿主免疫系統(tǒng)的相關性,仍具有重要的理論及應用意義。前期研究證明,EV-A71和CV-A16均可通過呼吸道感染人體,而呼吸道上皮細胞的胞內(nèi)外均具有系統(tǒng)的模式識別受體(pattern recognition receptor PRR[1]),這些PRR對各類病原相關分子模式(pathogen-associated molecular pattern PAMP[1])均具有識別的能力[2],從而啟動天然免疫反應相關信號分子的表達調(diào)控程序。迄今為止,對腸道病毒與支氣管上皮細胞間的相互作用及其對天然免疫反應信號變化趨勢的影響仍尚未明確。因此,本研究設計了作為腸道病毒主要抗原的VP1蛋白在支氣管上皮細胞16HBE中的單獨表達體系,來探究其對天然免疫相關信號分子的表達及T細胞免疫反應的影響[2]。首先擴增EV-A71和CV-A16的VP1序列,分別插入至載體pcDNA3.1(+),構建重組真核表達質(zhì)粒pcDNA-EV-A71-VP1和pcDNA-CV-A16-VP1。經(jīng)雙酶切及測序鑒定,兩種重組質(zhì)粒均正確構建,并且經(jīng)Wester blot檢測VP1蛋白均表達正確。然后分別轉(zhuǎn)染人支氣管上皮細胞16HBE,于轉(zhuǎn)染后24、48和72 h收集樣本,實時定量PCR法檢測16HBE細胞中天然免疫反應相關信號分子的表達情況[2]。結(jié)果表明:一方面,EV-A71-VP1和CV-A16-VP1兩個實驗組的信號分子表達譜在時間和數(shù)量上呈現(xiàn)截然不同的特點。轉(zhuǎn)染后24h到72h,EV-A71-VP1實驗組的表達量呈現(xiàn)出跳躍式的起伏,特別是 IFN-β、OX40L、IFN-a、IFN-γ、RANKL、IL-2,在 24h 時相較于基線對照均處于10倍至350倍的高位,而48h則劇烈降至10倍以下的水平。但CV-A16-VP1實驗組的表達量則在時間上趨于穩(wěn)定,而且數(shù)量上始終處于10倍以下的水平。另一方面,我們發(fā)現(xiàn)CV-A16-VP1實驗組上調(diào)而EV-A71-VP1實驗組下調(diào)的信號分子基本是發(fā)揮抗炎作用的因子,如IL-4、IL-13、GITRL;相反的,CV-A16-VP1實驗組下調(diào)、EV-A71-VP1實驗組上調(diào)的信號分子則基本是促炎因子。因此,結(jié)果表明EV-A71的VP1在一定程度上啟動了機體的天然免疫反應,而CV-A16的VP1效果卻不明顯。最后,為評價以上天然免疫相關信號分子的綜合效應,本實驗進行了人IFN-γ特異性Elispot實驗,發(fā)現(xiàn)兩個病毒實驗組的結(jié)果具有相似性,即T細胞都發(fā)生了顯著的非特異性增殖;但經(jīng)DC細胞遞呈后的T細胞卻都沒有顯著的特異性增殖。綜上所述,腸道病毒EV-A71和CV-A16的VP1蛋白在16HBE中分別表達后,細胞中天然免疫相關信號分子的表達情況具有差異性[2];但對T細胞非特異性增殖和特異性增殖的作用具有相似性。因此,本實驗為進一步探討不同腸道病毒早期通過呼吸道感染機體的機制提供了實驗依據(jù)。
【圖文】：

圖１腸道病毒的胞內(nèi)增殖過程逡逑３．天然免疫的分子機制逡逑在２０世紀６０年代到９０年代，獲得性免疫應答主導了免疫生物學，直到一位逡逑致力于Ｔ細胞免疫學研宄的學者——察爾斯？簡威（Ｃｈａｒｌｅｓ邋Ｊａｎｅｗａｙ）邋［１８］在１９８９逡逑年發(fā)表了一篇文章，指出人們普遍低估了先天免疫系統(tǒng)的作用［１９］。他首次提出了抗逡逑原呈遞細胞上存在模式識別受體（ｐａｔｔｅｒｎ邋ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ邋ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，邋ＰＲＲ－２°＿），，其逡逑是一種可以感知病原體的化學產(chǎn)物的特定基序［２１］，然后指導Ｔ細胞去執(zhí)行不同功能。逡逑這個新的假說紛紛遭到質(zhì)疑，但十多年后，法國生物化學家朱爾斯？霍夫曼（Ｊｕｌｅｓ逡逑Ｈｏｆｆｍａｎｎ）的昆蟲的Ｔｏｌｌ受體、美國遺傳學家布魯斯？比托勒（Ｂｒｕｃｅ邋Ｂｅｕｔｌｅｒ）逡逑的哺乳動物中的研究則有力的證明了該假說的成立［２２’２３］。因此，他倆聯(lián)合獲得２０１１逡逑年諾貝爾獎。其實，ＰＡＭＰ和ＤＡＭＰ在多大程度上通過非自身或自身信號來誘導獲得逡逑性免疫反應來影響免疫耐受仍然是一個有爭議的討論問題［２４’２５］。早在２０世紀７０逡逑年代，美國洛克菲勒大學的加拿大免疫學家（Ｒａｌｐｈ邋Ｓｔｅｉｎｍａｎ）邋［２１］就開始研究該概逡逑念中的關鍵參與者：樹突狀細胞Ｍ。他證明了樹突細胞是比巨噬細胞更有效的抗原逡逑呈遞細胞，并且它們是Ｔ細胞的主要指導者。所以斯坦曼成為了第三位獲得２０１１逡逑

的免疫應答的激活。那么激活了天然免疫之后呢？邋Ｋａｕｆｍａｒｍ等人制作了一個天然免逡逑疫與適應性免疫的聯(lián)系思維導圖，將關鍵節(jié)點羅列出來，可以讓我們更好的有一個逡逑框架式的理解，如
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R392

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本文編號：2697781