【摘要】：目的1、桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的方法及蛋白表達(dá)優(yōu)化條件的建立;2、通過(guò)桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)風(fēng)疹病毒E1全長(zhǎng)重組蛋白,成功獲得相對(duì)純度的風(fēng)疹E1重組蛋白;3、為高靈敏度、高特異性血清學(xué)方法檢測(cè)抗原篩選奠定了基礎(chǔ),用于建立高靈敏度和高特異性血清學(xué)的檢測(cè)方法。方法通過(guò)將風(fēng)疹病毒E1蛋白與供體質(zhì)粒pFastBacHTA用限制性?xún)?nèi)切酶消化連接后轉(zhuǎn)化到DH10Bac ~(TM)E.colic中,在其感受態(tài)內(nèi)部進(jìn)行同源重組,用藍(lán)白斑和抗性進(jìn)行篩選,經(jīng)鑒定正確后提取含有RV-E1基因組的重組穿梭質(zhì)粒Bacmid-RV-E1轉(zhuǎn)染到Sf9細(xì)胞,收獲病毒培養(yǎng)上清,即為P1代重組桿狀病毒AcMNPV-RV-E1,使用P1代接種Sf9細(xì)胞擴(kuò)增病毒庫(kù),收獲細(xì)胞上清,即為P2代AcMNPV-RV-E1,經(jīng)CPE、IFA和PCR鑒定后表明含有RV-E1基因成功轉(zhuǎn)染細(xì)胞,并在細(xì)胞中進(jìn)行組裝、復(fù)制和表達(dá)。同上方法接種細(xì)胞,收獲AcMNPV-RV-E1病毒庫(kù)。終點(diǎn)稀釋法稀釋病毒接種細(xì)胞,按不同MOI值接種細(xì)胞,進(jìn)行空斑實(shí)驗(yàn),測(cè)得病毒滴度。對(duì)重組桿狀病毒擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化,找出最適宜收獲目的蛋白的天數(shù)。進(jìn)而通過(guò)鎳柱親和層析法對(duì)含有RV-E1目的蛋白進(jìn)行純化,并對(duì)目的蛋白的表達(dá)進(jìn)行鑒定。結(jié)果通過(guò)PCR擴(kuò)增技術(shù),成功獲得風(fēng)疹E1的目的基因,同時(shí)與供體質(zhì)粒pFastBacHTA相連,轉(zhuǎn)化到DH10Bac~(TM)E.coli感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行同源重組,提取含有RV-E1的Bacmid重組穿梭質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染于Sf9細(xì)胞中,經(jīng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)后鑒定正確,能夠表達(dá)出目的蛋白,并對(duì)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化后,接種收獲蛋白,進(jìn)行純化。經(jīng)鑒定得出,目的蛋白不僅可以被風(fēng)疹特異性兔多克隆抗體和6*His單克隆鼠抗體識(shí)別,還可以與風(fēng)疹陽(yáng)性人血清發(fā)生結(jié)合,表明該蛋白具有免疫反應(yīng)性。結(jié)論1、通過(guò)PCR擴(kuò)增,成功獲得RV-E1目的基因,與pGEM-T載體連接克隆,經(jīng)鑒定后與供體質(zhì)粒pFastBacHTA雙酶切連接,轉(zhuǎn)化到DH10Bac ~(TM)E.coli感受態(tài)細(xì)胞克隆,提取重組穿梭質(zhì)粒,感染Sf9細(xì)胞,經(jīng)鑒定后,表明重組桿狀病毒能夠在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行組裝、復(fù)制,成功獲得含有目的基因的重組桿狀病毒;2、經(jīng)WB、DB鑒定后,能夠與抗體(特異性兔抗、6*His抗體)及RV陽(yáng)性血清產(chǎn)生反應(yīng),表明RV-E1均能與不同種屬的抗體進(jìn)行反應(yīng),具有良好的免疫反應(yīng)性。優(yōu)化表達(dá)條件后成功表達(dá)風(fēng)疹E1蛋白,為建立應(yīng)用于血清學(xué)的檢測(cè)方法及抗體篩選奠定了基礎(chǔ),可用于血清學(xué)應(yīng)用。
【圖文】：

1-A段和RV-E1-B段基因進(jìn)行擴(kuò)增，分別得到如表基因片段，電泳條帶如圖1-1、圖1-2所示：圖1-1 RV-E1 A段PCR擴(kuò)增結(jié)果NA marker DL2000； 1：陰性對(duì)照； 2：RV-E1基因Ae 1-1. The results for PCR amplification of RV-E1 gene As marker DL2000； 1: Negative； 2: RV-E1 A segmen

圖1-3 RV-E1基因全長(zhǎng)PCR擴(kuò)增結(jié)果: DNA marker DL2000； 1: RV-E1基因全長(zhǎng)PCR擴(kuò)增產(chǎn) 1-3. The results for full-length PCR amplification of RVmarker DL2000； 1: Full-length PCR amplification of PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送公司進(jìn)行測(cè)序，通過(guò)A段、B段到RV-E1全長(zhǎng)，，與GeneBank下載序列2B型毒株少了一個(gè)堿基G，核酸1142位由C→T，導(dǎo)致氨膠電泳顯示A段大小為1036bp，B段大小為819全長(zhǎng)T-A克隆重組質(zhì)粒的構(gòu)建因T-A克隆重組質(zhì)粒的鑒定酶得到的RV-E1基因PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化后過(guò)T-A互補(bǔ)作用進(jìn)行連接，得到含有RV-E1的T
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2697130