【摘要】：目的口腔牙周支持組織破壞是牙周炎的主要表現(xiàn),同時(shí)也是牙脫落的主因。隨著再生醫(yī)學(xué)這個(gè)概念的創(chuàng)立以及組織再生技術(shù)這些年的發(fā)展,從病人體內(nèi)獲取種子細(xì)胞并在體外擴(kuò)大增殖再輸入組織缺損的部位,以重構(gòu)患者殘缺的牙周組織,是解決牙周喪失問題新的發(fā)展方向。但干細(xì)胞體外培養(yǎng)中使用的動(dòng)物血清成分復(fù)雜,在未來臨床應(yīng)用中可能引發(fā)異基因的免疫反應(yīng)以及潛在的人畜共患病等風(fēng)險(xiǎn)。血小板裂解液(Human Platelet Lysate,HPL)是血小板破裂后,儲(chǔ)存于血小板α顆粒內(nèi)的大量生長因子釋放至外環(huán)境中所獲得的一種生長因子富集物。本實(shí)驗(yàn)探索HPL對(duì)人牙髓間充質(zhì)細(xì)胞(human Dental Pulp Mesenchymal Cells,h DPSCs)體外增殖與成骨分化的影響并研究其作用機(jī)制,為HPL替代胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)作用于h DPSCs的體外擴(kuò)增提供依據(jù)。方法分別使用5%、10%、20%的HPL以及10%FBS對(duì)健康牙髓組織分別進(jìn)行原代培養(yǎng)。細(xì)胞成活后使用倒置熒光顯微鏡及掃描電鏡觀察細(xì)胞形狀與狀態(tài),并計(jì)算組織塊的成活率;流式細(xì)胞術(shù)對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞特異性的表面抗原CD34、CD45、CD44、CD90、CD105以及Stro-1的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè);使用增殖及毒性檢測(cè)試劑盒(cell proliferation and toxicity test kit,cck-8)分別在1d、2d、3d至7d檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況;臺(tái)盼藍(lán)溶液染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞之活性;實(shí)時(shí)熒光下聚合酶鏈?zhǔn)降姆磻?yīng)(Real time quantitive-polymerase chain reaction,Q-PCR)檢測(cè)成骨相關(guān)基因堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)、骨鈣蛋白(osteocalcin,OCN)以及runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(runt-related transcription factor 2,RUNX2)的表達(dá);茜素紅溶液法染色檢測(cè)細(xì)胞體外成骨礦化能力。所獲得所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組均有成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞從組織塊中長出,倒置熒光顯微鏡與掃描電子顯微鏡下觀察其形態(tài)相似,均為長梭形,偶見多角形。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示CD34(㧟),CD45(㧟),CD44(㧏),CD90(㧏),CD105(㧏),Stro-1(㧏),其符合人間充質(zhì)來源干細(xì)胞的表型特征;cck-8結(jié)果顯示10%HPL組h DPSCs增殖速度相較于10%FBS組更快,5%HPL組在第4d時(shí)與10%FBS組細(xì)胞增殖速度相當(dāng),各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。茜素紅染色顯示10%HPL組細(xì)胞成骨能力優(yōu)于10%FBS組;Q-PCR結(jié)果表明10%HPL組在成骨基因BMP-2,ALP,OCN以及RUNX2的表達(dá)方面,均優(yōu)于10%FBS組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論10%HPL可以有效促進(jìn)人牙髓間充質(zhì)細(xì)胞的體外擴(kuò)增以及成骨分化,可以代替FBS作為牙髓間充質(zhì)細(xì)胞體外擴(kuò)增時(shí)的添加物,為牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床安全應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

胞培養(yǎng) 5-12 d 后，各組均有成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞從組織塊邊緣爬出，，規(guī)則呈長梭形，并以旋渦狀排列，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞胞膜完整，細(xì)量的細(xì)胞基質(zhì)；使用 HPL 培養(yǎng)的細(xì)胞立體感更強(qiáng)，期間可以發(fā)現(xiàn)少（圖 1，圖 2）。

圖 2 SEM 下細(xì)胞形態(tài)Fig 2 Cell morphology under SEM胞活性的檢測(cè)結(jié)果顯示：10% HPL 組細(xì) HPL 組細(xì)胞的活性最低（68.583±3.519%P=0.0281）（表 2）。表 2 各組細(xì)胞細(xì)胞成活率、活率（ x ± s）2 Cell survival rate and activity of each group（ x0% FBS 5% HPL 10% HPL 0±8.2 26.7±4.7 70±14.1 5±1.882 68.583±3.519 88.424±1.866
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R329.2

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本文編號(hào)：2694828