發(fā)布時(shí)間：2020-06-03 10:29

【摘要】：目的:研究L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯氧化酶(L-gulono-γ-lactone oxidase,Gulo)在C57BL/6小鼠胚胎腎臟中的表達(dá),以及對(duì)后腎間充質(zhì)(metanephric mesenchyme,MM)細(xì)胞增殖、凋亡、間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化(mesenchymal-to-epithelial transformation,MET)過(guò)程的影響,進(jìn)而闡明Gulo在腎臟發(fā)育過(guò)程中的潛在生物學(xué)功能。方法:1.分離不同發(fā)育時(shí)期的C57BL/6小鼠胚胎腎臟,利用RT-qPCR檢測(cè)Gulo的表達(dá)情況;培養(yǎng)不同發(fā)育階段的MM細(xì)胞,mK3細(xì)胞和mK4細(xì)胞,通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)Gulo在這兩種細(xì)胞的表達(dá)情況。2.在mK3細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Gulo,在mK4細(xì)胞中敲低Gulo,免疫印跡試驗(yàn)(Western blot,WB)檢測(cè)細(xì)胞的MET標(biāo)志物和Sine oculis-related homeobox 2(Six2)的變化;細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力的改變。5-乙炔基-2’-脫氧尿苷(5-Ethynyl-2’-deoxyuridine,Edu)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。3.在過(guò)表達(dá)Gulo的mK3細(xì)胞中再轉(zhuǎn)染Six2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒,在敲低Gulo的mK4細(xì)胞轉(zhuǎn)染Six2敲低質(zhì)粒,Western blot檢測(cè)細(xì)胞的MET過(guò)程相關(guān)標(biāo)志物的變化;細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)遷移能力的改變。Edu實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果:1.Gulo在C57BL/6小鼠胚胎腎臟中胚胎期12.5天(embryonic12.5 days,E12.5)表達(dá)顯著增多,在未分化的MM(mK3)細(xì)胞中Gulo表達(dá)低于已分化的MM(mK4)細(xì)胞。2.過(guò)表達(dá)Gulo可促進(jìn)mK3細(xì)胞的MET和細(xì)胞凋亡過(guò)程,抑制細(xì)胞增殖。mK4細(xì)胞中Gulo的敲低使其上皮特性減弱,促進(jìn)細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞凋亡。3.Six2受Gulo負(fù)調(diào)控。在過(guò)表達(dá)Gulo的mK3細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Six2,在敲低Gulo的mK4細(xì)胞中敲低Six2,可部分挽救由于Gulo增多或缺乏引起的MM細(xì)胞的MET、增殖和凋亡改變。結(jié)論:綜上所述,我們的研究結(jié)果表明Gulo在小鼠胚胎腎臟中E12.5表達(dá)顯著升高,未分化的MM(mK3)細(xì)胞Gulo表達(dá)顯著低于已分化的MM(mK4)細(xì)胞。此外,Gulo通過(guò)負(fù)調(diào)控Six2從而促進(jìn)MM細(xì)胞的MET和凋亡,抑制其增殖。
【圖文】：

1 Gulo 在腎臟發(fā)育不同階段表達(dá)情況（RT-qPCRssion in different stages of kidney development (RT** p <0.01, ns. non-significant.育階段的 MM 細(xì)胞中差異表達(dá)lo 在不同發(fā)育階段的 MM 細(xì)胞中的表達(dá)情 PCR（Semi-quantitative PCR，SqPCR）在 的表達(dá)。mK3 和 mK4 細(xì)胞系代表兩個(gè)不同早期未經(jīng) UB 誘導(dǎo)的 MM 細(xì)胞，為間質(zhì)細(xì)胞胞，為已發(fā)生部分上皮化的細(xì)胞。結(jié)果表明而在 mK4 細(xì)胞中表達(dá)較高（圖 2）。

圖 1 Gulo 在腎臟發(fā)育不同階段表達(dá)情況（RT-qPCR） expression in different stages of kidney development (RT-qPC** p <0.01, ns. non-significant.同發(fā)育階段的 MM 細(xì)胞中差異表達(dá) Gulo 在不同發(fā)育階段的 MM 細(xì)胞中的表達(dá)情況，，半定量 PCR（Semi-quantitative PCR，SqPCR）在 mK3 Gulo 的表達(dá)。mK3 和 mK4 細(xì)胞系代表兩個(gè)不同分化階細(xì)胞為早期未經(jīng) UB 誘導(dǎo)的 MM 細(xì)胞，為間質(zhì)細(xì)胞；mM 細(xì)胞，為已發(fā)生部分上皮化的細(xì)胞。結(jié)果表明，Gu低，而在 mK4 細(xì)胞中表達(dá)較高（圖 2）。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R329.2

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