【摘要】：1918年流感大流行距今已有整整100年的時(shí)間,這100年來流感病毒時(shí)時(shí)刻刻都威脅著人類的生命健康,同時(shí)還給人類帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。人類亟待從根本上認(rèn)識流感病毒,剖析其復(fù)制傳播和致病機(jī)制,并以此為基礎(chǔ)開發(fā)高效流感疫苗和特效藥物。隨著上個(gè)世紀(jì)六十年代末期分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步和成熟,基因重組技術(shù)開始被廣泛的應(yīng)用于生命科學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域。在此后的幾十年中,流感病毒反向遺傳學(xué)技術(shù)得到了極大的發(fā)展并為流感病毒的致病機(jī)制研究,以及流感疫苗的研發(fā)工作提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。二十世紀(jì)末,科學(xué)家們開始嘗試?yán)昧鞲胁《痉聪蜻z傳學(xué)技術(shù)構(gòu)建各種不同類型的復(fù)制缺陷型流感病毒。復(fù)制缺陷型流感病毒最大的特點(diǎn)是復(fù)制依賴于外源性的蛋白補(bǔ)償,在天然宿主細(xì)胞中僅發(fā)生單輪感染并不能進(jìn)行復(fù)制增殖。較之野生型病毒,復(fù)制缺陷型流感病毒的生物安全性得到了極大的提高。但目前復(fù)制缺陷型流感病毒相關(guān)研究工作存在一定的局限性,研究工作大多在細(xì)胞水平上開展,缺乏相應(yīng)的動(dòng)物模型與之配合。本課題以2009年甲型H1N1流感病毒A/Changchun/01/2009(H1N1)的鼠適應(yīng)株UIXD-P18-2(UI182)為骨架,利用8質(zhì)粒流感病毒反向遺傳學(xué)系統(tǒng),通過體外拯救獲得了一株復(fù)制缺陷型甲型H1N1流感病毒,并構(gòu)建了相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株以及轉(zhuǎn)基因小鼠感染模型,為更充分的利用復(fù)制缺陷型流感病毒開展流感病毒復(fù)制傳播和致病機(jī)制的相關(guān)研究提供技術(shù)層面上的支持。本研究分別從以下四個(gè)方面展開:一、構(gòu)建10株用于復(fù)制缺陷型甲型H1N1流感病毒體外拯救或體外增殖的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株。通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染結(jié)合抗生素篩選、觀察報(bào)告基因表達(dá)情況以初步篩選、以RT-PCR和Western blotting等方法從基因和蛋白水平對外源基因在細(xì)胞中的表達(dá)情況進(jìn)行鑒定等方法成功構(gòu)建和鑒定了 10株分別穩(wěn)定表達(dá)甲型H1N1流感病毒聚合酶蛋白PB1、聚合酶蛋白PB2、聚合酶蛋白PA、核蛋白NP和基質(zhì)蛋白M1的293T轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株或MDCK轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株,分別命名為293T-PB1轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株、293T-PB2轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株、293T-PA轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株、293T-NP轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株、293T-M1轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株、MDCK-PB1轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株、MDCK-PB2轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株、MDCK-PA轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株、MDCK-NP轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株和MDCK-M1轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株。二、通過體外拯救獲得了 1株復(fù)制缺陷型甲型H1N1流感病毒(毒株命名PB2-D)。以2009年甲型H1N1流感病毒的鼠適應(yīng)株UI182的感染性克隆為基礎(chǔ),通過點(diǎn)突變的方法分別在感染性克隆的PB1、PB2、PA、NP或M1質(zhì)�；蚓幋a區(qū)中插入終止子突變,構(gòu)建了 5個(gè)復(fù)制缺陷型感染性克隆UI182-PB1-D、UI182-PB2-D、UII182-PA-D、UI182-NP-D和UI182-M1-D。將復(fù)制缺陷型感染性克隆分別同其余7個(gè)未經(jīng)改造的感染性克隆共轉(zhuǎn)染至相應(yīng)的293T轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株中進(jìn)行復(fù)制缺陷型病毒的體外拯救。結(jié)果成功拯救出1株復(fù)制缺陷型甲型H1N1流感病毒,并將其命名為PB2-D。通過電鏡觀察、血凝試驗(yàn)鑒定、RT-PCR鑒定和全基因組測序等方法對PB2-D進(jìn)行了鑒定。鑒定結(jié)果表明,PB2-D具有流感病毒的典型形態(tài),能夠凝集雞紅細(xì)胞,具有流感病毒表面血凝素的基本特性,PB2-D包含的8個(gè)基因節(jié)段符合甲型H1N1流感病毒的基因組特征且?guī)в型蛔儤?biāo)記。三、復(fù)制缺陷型甲型H1N1流感病毒的安全性分析與初步應(yīng)用。我們分析了復(fù)制缺陷型甲型H1N1流感病毒PB2-D在MDCK細(xì)胞、MDCK-PB2轉(zhuǎn)基因細(xì)胞、SPF雞胚以及C57/BL6小鼠中的復(fù)制能力。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)PB2-D僅能在MDCK-PB2轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制,并表現(xiàn)出與親本毒UI182相似的復(fù)制特性,然而,PB2-D不能夠在MDCK細(xì)胞、雞胚和C57/BL6小鼠體內(nèi)進(jìn)行有效復(fù)制,以上結(jié)果表明復(fù)制缺陷型甲型H1N1流感病毒具有良好的安全性。此外,我們成功構(gòu)建H5亞型和H7亞型的復(fù)制缺陷型流感病毒H5-PB2-D和H7-PB2-D并將之應(yīng)用于流浪犬血清相關(guān)抗體的檢測,并在流浪犬體內(nèi)發(fā)現(xiàn)H7抗體存在的證據(jù)。四、穩(wěn)定表達(dá)甲型H1N1流感病毒PB2蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建及初步應(yīng)用。通過原核注射的方式將甲型H1N1流感病毒鼠適應(yīng)株UI182株的PB2基因轉(zhuǎn)移至小鼠受精卵中。通過PCR擴(kuò)增對外源基因在子代小鼠基因組中的整合情況進(jìn)行鑒定,結(jié)果顯示成功獲得雌雄各1只,共2只GO代小鼠,GO代小鼠體內(nèi)GFP報(bào)告基因表達(dá)呈陽性。對G1代小鼠體內(nèi)外源基因表達(dá)情況進(jìn)行RT-PCR和Western blotting分析的結(jié)果顯示PB2基因在G1代小鼠肺中可以被轉(zhuǎn)錄為mRNA并翻譯為相應(yīng)的蛋白。以上結(jié)果表明,我們成功構(gòu)建了表達(dá)流感病毒UI182PB2蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠。將復(fù)制缺陷型甲型H1N1流感病毒PB2-D接種該轉(zhuǎn)基因小鼠后,可以于接種后的第3天在轉(zhuǎn)基因小鼠肺內(nèi)檢測到病毒PB2-D的復(fù)制,病毒滴度為103.03 TCID50/mL,表明復(fù)制缺陷型甲型H1N1流感病毒可以在轉(zhuǎn)基因小鼠肺臟中進(jìn)行復(fù)制。綜上所述,本研究成功獲得了 1株復(fù)制缺陷型甲型H1N1流感病毒,并對該病毒的生物學(xué)特性和安全性進(jìn)行了分析。分析結(jié)果顯示,PB2-D具有流感病毒的典型形態(tài),在穩(wěn)定表達(dá)病毒PB2蛋白的MDCK-PB2轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中的復(fù)制能力與親本病毒UI182無差異,但PB2-D無法在MDCK細(xì)胞、雞胚和小鼠體內(nèi)進(jìn)行復(fù)制,上述結(jié)果表明本研究構(gòu)建的復(fù)制缺陷型甲型H1N1流感病毒具有良好的生物安全性,其構(gòu)建策略適用于高致病性流感病毒的體內(nèi)外相關(guān)評價(jià)和研究,可為從事研究的人員提供更高的安全保障。此外,為了擴(kuò)大復(fù)制缺陷型甲型H1N1流感病毒的應(yīng)用范圍,我們成功構(gòu)建了可穩(wěn)定表達(dá)甲型H1N1流感病毒PB2蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠來作為與復(fù)制缺陷型甲型H1N1流感病毒配合使用的動(dòng)物模型。試驗(yàn)結(jié)果表明,復(fù)制缺陷型甲型H1N1流感病毒PB2-D能夠成功感染該轉(zhuǎn)基因小鼠,并在其肺臟內(nèi)復(fù)制。本課題研究成果對利用復(fù)制缺陷型流感病毒開展流感病毒復(fù)制、傳播、致病機(jī)制以及疫苗研發(fā)等工作具有重要的指導(dǎo)意義和推進(jìn)作用。
【圖文】：

種蛋白在病毒表面的分布不均勻，，數(shù)量差異較大，蛋白量的８０％、１８％和２％。內(nèi)部的病毒核糖核ＲＮＡ與ＮＰ、核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ｎｕｃｌｅａｒ邋ｅｘｐｏｒｔ邋ｐｒｏｔｅｉｎ，物共同組成，外觀呈韌性棒狀結(jié)構(gòu)。聚合酶蛋白合酶蛋白Ｋｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｂａｓｉｃ邋１，ＰＢ１）、堿性聚合酶酸性聚合酶蛋白（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ邋ａｃｉｄ，ＰＡ）邋［２２．２３】（毒的基因組包括８個(gè)負(fù)鏈ＲＮＡ節(jié)段分別為ＨＡ、結(jié)構(gòu)蛋白（ｎｏｎ－ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｐｒｏｔｅｉｎ，ＮＳ）基因，可。除邋ＨＡ、ＮＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍｌ、Ｍ２、ＮＳ了數(shù)個(gè)新的流感病毒蛋白成分，如堿性聚合酶ｓｉｃ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋１－Ｆ２，邋ＰＢ１－Ｆ２）、ＰＢ１－Ｎ４０、ＰＡ－Ｘ、ＰＡ－Ｎ流感病毒復(fù)制的過程即是所有病毒蛋白有序協(xié)作

Ｍ４２和ＮＳ３等，流感病毒復(fù)制的過程即是所有病毒蛋白有序協(xié)作的結(jié)果。逡逑呡！逡逑圖１．邋１甲型流感病毒粒子示意圖逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．１邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｔｈｅ邋ｉｎｆｌｕｅｎｚａ邋Ａ邋ｖｉｒｉｏｎ［３３］逡逑１．邋２流感病毒的復(fù)制逡逑流感在宿主細(xì)胞內(nèi)的感染過程起始于病毒粒子與宿主細(xì)胞表面唾液酸受體的逡逑結(jié)合，與唾液酸受體結(jié)合后病毒通過細(xì)胞內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。然后，病毒粒子外逡逑８逡逑
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R373.13

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前5條

1 楊勇;周東明;;腺病毒載體疫苗的臨床研究進(jìn)展[J];生命的化學(xué);2014年01期

2 胡奇嬋;陳s

本文編號：2693170