【摘要】：背景:Hippo信號通路是協(xié)調(diào)機體內(nèi)細胞增殖和分化,控制器官大小和組織再生的信號通路。核心激酶large tumor suppressor 1/2(LATS1/2)和mammalian Sterile 20-like kinases 1/2(MST1/2)被上游信號激活后,抑制轉錄共激活因子yes-associated protein(YAP)/transcriptional coactivator with PDZ-binding motif(TAZ)入核,進而負向調(diào)控器官發(fā)育與再生。除了參與控制器官大小和組織再生外,Hippo信號通路在干細胞及祖細胞自我更新、代謝、免疫和腫瘤的發(fā)生發(fā)展等生物學過程中也發(fā)揮重要作用。LATS1/2是否磷酸化YAP是Hippo信號通路激活與關閉的關鍵環(huán)節(jié),但LATS1/2作為抑癌基因,對其獨立于YAP發(fā)揮功能的研究較少。肝臟是人體最大的代謝器官之一,而Hippo信號通路對肝癌和肝臟的再生等都有很重要的作用,但是Hippo信號通路和代謝的相關研究較之其他調(diào)控領域更少。因此,本論文將肝臟組織mRNA構建成酵母菌株文庫,通過酵母雙雜交技術(Yeast Two-Hybrid Systems,Y2H)篩選肝臟中與LATS2互作的蛋白并進一步研究其功能。YAP作為Hippo信號通路發(fā)揮作用的下游效應分子,對Hippo信號通路行使功能必不可少,雖然已有相關研究鑒定出影響YAP活性的直接或間接調(diào)控因子(AMOT,VGLL4和BRD4),但是關于YAP的生物學功能仍然存在一些問題尚待解決,例如YAP如何結合表觀因子,YAP的C端轉錄激活域如何發(fā)揮功能等。為了系統(tǒng)解決這些問題,本課題利用BioID(proximity-dependent biotin identification)方法篩選YAP潛在的互作蛋白。該方法主要基于一種改造的生物素連接酶BirA*,它能將鄰近蛋白進行生物素化標記,通過鏈霉親和素珠子將生物素標記的蛋白進行富集,被生物素化的蛋白通過質譜分析,可初步鑒定出YAP鄰近的蛋白和潛在的互作蛋白。目的:分別利用酵母雙雜交和BioID蛋白互作組學方法,尋找和Hippo信號通路核心因子LATS2和YAP互作的蛋白,并進一步進行功能驗證和分析,為研究Hippo信號通路的調(diào)控和病理學功能提供依據(jù)。方法:選取LATS1/2蛋白中的LATS2,將它的相關結構域與Gal4的DNA結合結構域構建成融合質粒,通過免疫印跡檢測蛋白表達。對融合質粒進行自激活和毒性測試,確認可以進行酵母雙雜交篩選后,將表達融合質粒的菌株與肝臟組織的酵母菌株文庫共同孵育,篩選肝臟組織中與LATS2互作的蛋白,通過報告基因(His3、LacZ和Leu2)的表達篩選出陽性克隆并利用測序比對篩選正確整合表達的蛋白,將選擇的候選蛋白與HA標簽融合表達,LATS2與Flag標簽融合表達,共轉染293T細胞,通過免疫共沉淀檢測候選蛋白和LATS2的互作。YAP作為轉錄共激活因子,在酵母雙雜交系統(tǒng)中存在自激活現(xiàn)象。因此,采用BioID方法來篩選YAP的互作蛋白。將結果進行聚類、通路和功能分析,從中挑選40個候選基因,每個基因設計兩條特異性的shRNA,利用TBS-Luciferase雙熒光報告系統(tǒng)檢測候選基因敲低對YAP活性的影響,實時熒光定量PCR(qPCR)檢測候選基因敲低對Hippo信號通路下游靶基因表達的影響。結果:通過酵母雙雜交篩選到肝臟組織中與LATS2互作的蛋白有22種(PARP9、FGA、SERPINF1、PLOD1、RBP4、AZGP1、AOX1、MST122、MST127、HPX、ATP synthase6、CP、EF1a、WDR6、POLR1B、HPN、NOL11、ZNF350、PSAP、FGB、NR2F6、ALDH2),選擇PARP9、WDR6、NOL11、AZGP1、ZNF350、HPX、ALDH2、AOX1作為候選蛋白進行酵母雙雜交回復驗證,并用磷酸化預測工具(http://www.phosphonet.ca/default.aspx)預測它們是否可以被LATS1/2磷酸化以及磷酸化的位點。根據(jù)回復驗證和磷酸化位點預測的結果選擇PARP9、WDR6、NOL11、ALDH2、AOX1進行互作驗證,免疫共沉淀結果顯示:ALDH2(Aldehyde dehydrogenase,mitochondrial)和LATS2存在較強的相互作用,已知ALDH2參與酒精代謝,且酒精中毒與ALDH2密切相關。這提示我們:LATS2可能參與ALDH2調(diào)節(jié)的酒精代謝。通過BioID技術篩選到293T細胞中與YAP鄰近的蛋白有1000多種,經(jīng)聚類、通路和功能分析,發(fā)現(xiàn)有機械張力、細胞骨架、轉錄調(diào)節(jié)、表觀遺傳等相關基因可能參與調(diào)控YAP,其中已知的有NEDD4、CBLC、HSP90AB2P、CDK2、LATS、MST和AMOT,未知的有WDR26、STRAP、TRIM25、RANBP2、TFG、KHSRP、TES、SEPT7等。與KEGG收錄的Hippo信號通路成員和Biogrid收錄的與YAP1互作的蛋白進行比對后,選擇40個基因作為候選基因,通過TBS-Luciferase雙熒光報告系統(tǒng)和qPCR分別檢測候選基因敲低對YAP活性和Hippo信號通路下游靶基因的影響,結果顯示:PRDX6、TPD52、TRIM25和TRIM33的敲低抑制YAP的活性及其靶基因的轉錄。結論:LATS1/2可能參與ALDH2調(diào)控的酒精代謝;利用BioID方法篩選出多個YAP的調(diào)節(jié)因子如COR1B、TRIM25、TRIM33等。這提示還有更多機械張力、細胞骨架、轉錄調(diào)節(jié)、表觀遺傳等相關基因可能參與調(diào)控YAP的活性。
【圖文】：

圖 1. Hippo 信號通路示意圖LATS2作為Hippo信號通路核心激酶中的一員，在組織器官發(fā)育中發(fā)揮重要作用。LATS2 是 AGC 家族的 Ser/Thr 激酶，C-端是高度保守的激酶結構域，N-端有一個 PPxY（P：脯氨酸；x：任意氨基酸；Y：酪氨酸）基序和一個 UBA 結構域（ubiquitin associateddomain），PPxY 基序可以和有 WW 結構域的蛋白結合（如：YAP 和 TAZ），在 N-端還有一個可以和蛋白質互作的結構：脯氨酸-丙氨酸 7 次交替重復（PAPArepeat），，每個結構都可在機體內(nèi)參與特定的生命過程[7]（圖 2）。在哺乳動物各組織器官中LATS2 廣泛表達，但表達量存在差異，在人心臟和骨骼肌中的表達高于其它組織[9-11]。LATS2 參與細胞增殖、轉錄調(diào)控、組織器官發(fā)育和腫瘤發(fā)生等過程[12-14]。

圖 1. Hippo 信號通路示意圖LATS2作為Hippo信號通路核心激酶中的一員，在組織器官發(fā)育中發(fā)揮重要S2 是 AGC 家族的 Ser/Thr 激酶，C-端是高度保守的激酶結構域，N-端有一個：脯氨酸；x：任意氨基酸；Y：酪氨酸）基序和一個 UBA 結構域（ubiquitin assoain），PPxY 基序可以和有 WW 結構域的蛋白結合（如：YAP 和 TAZ），有一個可以和蛋白質互作的結構：脯氨酸-丙氨酸 7 次交替重復（PAPArepe結構都可在機體內(nèi)參與特定的生命過程[7]（圖 2）。在哺乳動物各組織器S2 廣泛表達，但表達量存在差異，在人心臟和骨骼肌中的表達高于其它組織S2 參與細胞增殖、轉錄調(diào)控、組織器官發(fā)育和腫瘤發(fā)生等過程[12-14]。
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R346

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本文編號：2692473