【摘要】：背景:Hippo信號通路是協(xié)調(diào)機(jī)體內(nèi)細(xì)胞增殖和分化,控制器官大小和組織再生的信號通路。核心激酶large tumor suppressor 1/2(LATS1/2)和mammalian Sterile 20-like kinases 1/2(MST1/2)被上游信號激活后,抑制轉(zhuǎn)錄共激活因子yes-associated protein(YAP)/transcriptional coactivator with PDZ-binding motif(TAZ)入核,進(jìn)而負(fù)向調(diào)控器官發(fā)育與再生。除了參與控制器官大小和組織再生外,Hippo信號通路在干細(xì)胞及祖細(xì)胞自我更新、代謝、免疫和腫瘤的發(fā)生發(fā)展等生物學(xué)過程中也發(fā)揮重要作用。LATS1/2是否磷酸化YAP是Hippo信號通路激活與關(guān)閉的關(guān)鍵環(huán)節(jié),但LATS1/2作為抑癌基因,對其獨立于YAP發(fā)揮功能的研究較少。肝臟是人體最大的代謝器官之一,而Hippo信號通路對肝癌和肝臟的再生等都有很重要的作用,但是Hippo信號通路和代謝的相關(guān)研究較之其他調(diào)控領(lǐng)域更少。因此,本論文將肝臟組織mRNA構(gòu)建成酵母菌株文庫,通過酵母雙雜交技術(shù)(Yeast Two-Hybrid Systems,Y2H)篩選肝臟中與LATS2互作的蛋白并進(jìn)一步研究其功能。YAP作為Hippo信號通路發(fā)揮作用的下游效應(yīng)分子,對Hippo信號通路行使功能必不可少,雖然已有相關(guān)研究鑒定出影響YAP活性的直接或間接調(diào)控因子(AMOT,VGLL4和BRD4),但是關(guān)于YAP的生物學(xué)功能仍然存在一些問題尚待解決,例如YAP如何結(jié)合表觀因子,YAP的C端轉(zhuǎn)錄激活域如何發(fā)揮功能等。為了系統(tǒng)解決這些問題,本課題利用BioID(proximity-dependent biotin identification)方法篩選YAP潛在的互作蛋白。該方法主要基于一種改造的生物素連接酶BirA*,它能將鄰近蛋白進(jìn)行生物素化標(biāo)記,通過鏈霉親和素珠子將生物素標(biāo)記的蛋白進(jìn)行富集,被生物素化的蛋白通過質(zhì)譜分析,可初步鑒定出YAP鄰近的蛋白和潛在的互作蛋白。目的:分別利用酵母雙雜交和BioID蛋白互作組學(xué)方法,尋找和Hippo信號通路核心因子LATS2和YAP互作的蛋白,并進(jìn)一步進(jìn)行功能驗證和分析,為研究Hippo信號通路的調(diào)控和病理學(xué)功能提供依據(jù)。方法:選取LATS1/2蛋白中的LATS2,將它的相關(guān)結(jié)構(gòu)域與Gal4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域構(gòu)建成融合質(zhì)粒,通過免疫印跡檢測蛋白表達(dá)。對融合質(zhì)粒進(jìn)行自激活和毒性測試,確認(rèn)可以進(jìn)行酵母雙雜交篩選后,將表達(dá)融合質(zhì)粒的菌株與肝臟組織的酵母菌株文庫共同孵育,篩選肝臟組織中與LATS2互作的蛋白,通過報告基因(His3、LacZ和Leu2)的表達(dá)篩選出陽性克隆并利用測序比對篩選正確整合表達(dá)的蛋白,將選擇的候選蛋白與HA標(biāo)簽融合表達(dá),LATS2與Flag標(biāo)簽融合表達(dá),共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,通過免疫共沉淀檢測候選蛋白和LATS2的互作。YAP作為轉(zhuǎn)錄共激活因子,在酵母雙雜交系統(tǒng)中存在自激活現(xiàn)象。因此,采用BioID方法來篩選YAP的互作蛋白。將結(jié)果進(jìn)行聚類、通路和功能分析,從中挑選40個候選基因,每個基因設(shè)計兩條特異性的shRNA,利用TBS-Luciferase雙熒光報告系統(tǒng)檢測候選基因敲低對YAP活性的影響,實時熒光定量PCR(qPCR)檢測候選基因敲低對Hippo信號通路下游靶基因表達(dá)的影響。結(jié)果:通過酵母雙雜交篩選到肝臟組織中與LATS2互作的蛋白有22種(PARP9、FGA、SERPINF1、PLOD1、RBP4、AZGP1、AOX1、MST122、MST127、HPX、ATP synthase6、CP、EF1a、WDR6、POLR1B、HPN、NOL11、ZNF350、PSAP、FGB、NR2F6、ALDH2),選擇PARP9、WDR6、NOL11、AZGP1、ZNF350、HPX、ALDH2、AOX1作為候選蛋白進(jìn)行酵母雙雜交回復(fù)驗證,并用磷酸化預(yù)測工具(http://www.phosphonet.ca/default.aspx)預(yù)測它們是否可以被LATS1/2磷酸化以及磷酸化的位點。根據(jù)回復(fù)驗證和磷酸化位點預(yù)測的結(jié)果選擇PARP9、WDR6、NOL11、ALDH2、AOX1進(jìn)行互作驗證,免疫共沉淀結(jié)果顯示:ALDH2(Aldehyde dehydrogenase,mitochondrial)和LATS2存在較強(qiáng)的相互作用,已知ALDH2參與酒精代謝,且酒精中毒與ALDH2密切相關(guān)。這提示我們:LATS2可能參與ALDH2調(diào)節(jié)的酒精代謝。通過BioID技術(shù)篩選到293T細(xì)胞中與YAP鄰近的蛋白有1000多種,經(jīng)聚類、通路和功能分析,發(fā)現(xiàn)有機(jī)械張力、細(xì)胞骨架、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、表觀遺傳等相關(guān)基因可能參與調(diào)控YAP,其中已知的有NEDD4、CBLC、HSP90AB2P、CDK2、LATS、MST和AMOT,未知的有WDR26、STRAP、TRIM25、RANBP2、TFG、KHSRP、TES、SEPT7等。與KEGG收錄的Hippo信號通路成員和Biogrid收錄的與YAP1互作的蛋白進(jìn)行比對后,選擇40個基因作為候選基因,通過TBS-Luciferase雙熒光報告系統(tǒng)和qPCR分別檢測候選基因敲低對YAP活性和Hippo信號通路下游靶基因的影響,結(jié)果顯示:PRDX6、TPD52、TRIM25和TRIM33的敲低抑制YAP的活性及其靶基因的轉(zhuǎn)錄。結(jié)論:LATS1/2可能參與ALDH2調(diào)控的酒精代謝;利用BioID方法篩選出多個YAP的調(diào)節(jié)因子如COR1B、TRIM25、TRIM33等。這提示還有更多機(jī)械張力、細(xì)胞骨架、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、表觀遺傳等相關(guān)基因可能參與調(diào)控YAP的活性。
【圖文】：

圖 1. Hippo 信號通路示意圖LATS2作為Hippo信號通路核心激酶中的一員，在組織器官發(fā)育中發(fā)揮重要作用。LATS2 是 AGC 家族的 Ser/Thr 激酶，C-端是高度保守的激酶結(jié)構(gòu)域，N-端有一個 PPxY（P：脯氨酸；x：任意氨基酸；Y：酪氨酸）基序和一個 UBA 結(jié)構(gòu)域（ubiquitin associateddomain），PPxY 基序可以和有 WW 結(jié)構(gòu)域的蛋白結(jié)合（如：YAP 和 TAZ），在 N-端還有一個可以和蛋白質(zhì)互作的結(jié)構(gòu)：脯氨酸-丙氨酸 7 次交替重復(fù)（PAPArepeat），，每個結(jié)構(gòu)都可在機(jī)體內(nèi)參與特定的生命過程[7]（圖 2）。在哺乳動物各組織器官中LATS2 廣泛表達(dá)，但表達(dá)量存在差異，在人心臟和骨骼肌中的表達(dá)高于其它組織[9-11]。LATS2 參與細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、組織器官發(fā)育和腫瘤發(fā)生等過程[12-14]。

圖 1. Hippo 信號通路示意圖LATS2作為Hippo信號通路核心激酶中的一員，在組織器官發(fā)育中發(fā)揮重要S2 是 AGC 家族的 Ser/Thr 激酶，C-端是高度保守的激酶結(jié)構(gòu)域，N-端有一個：脯氨酸；x：任意氨基酸；Y：酪氨酸）基序和一個 UBA 結(jié)構(gòu)域（ubiquitin assoain），PPxY 基序可以和有 WW 結(jié)構(gòu)域的蛋白結(jié)合（如：YAP 和 TAZ），有一個可以和蛋白質(zhì)互作的結(jié)構(gòu)：脯氨酸-丙氨酸 7 次交替重復(fù)（PAPArepe結(jié)構(gòu)都可在機(jī)體內(nèi)參與特定的生命過程[7]（圖 2）。在哺乳動物各組織器S2 廣泛表達(dá)，但表達(dá)量存在差異，在人心臟和骨骼肌中的表達(dá)高于其它組織S2 參與細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、組織器官發(fā)育和腫瘤發(fā)生等過程[12-14]。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R346

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