【摘要】：背景和目的:糖尿病是位列心血管疾病和腫瘤之后的第三大嚴重危害人類健康的疾病,主要分為胰島素分泌缺陷的1型糖尿病和胰島素作用缺陷的2型糖尿病(Type 2diabetes,T2D)。目前臨床上對T2D的治療主要為使用口服降糖藥物或注射外源性胰島素,如果患者的高血糖沒有得到有效控制,則可導(dǎo)致進行性的胰島β細胞損傷和糖尿病性腎衰、心臟病變、眼底病變、壞疽等并發(fā)癥。間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是一類具有自我復(fù)制和多向分化潛能的多能干細胞,具有免疫調(diào)節(jié)、抑制炎癥等特點。近年來,應(yīng)用MSCs治療T2D及其并發(fā)癥已成為糖尿病治療領(lǐng)域的研究熱點。與其他來源(如臍帶、骨髓、臍血等)的MSCs相比,人羊膜來源的MSCs(即人羊膜間充質(zhì)干細胞,Human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSCs)具有來源豐富、分離簡單、增殖能力強、無致瘤性,低免疫原性及高組織相容性等優(yōu)點。本課題旨在系統(tǒng)研究hAMSCs的特征以及hAMSCs對T2D小鼠模型的治療作用及其可能的分子機制,以期為臨床上T2D的治療提供新的方法和手段。方法:1.hAMSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定:1)將羊膜從胎盤上分離,依次經(jīng)胰酶及膠原酶消化得到hAMSCs單細胞懸液;2)將分離得到的hAMSCs接種在10cm培養(yǎng)皿中進行常規(guī)培養(yǎng);3)采用RT-PCR、流式細胞術(shù)及免疫熒光檢測hAMSCs間充質(zhì)干細胞、造血干細胞、胚胎干細胞及免疫源性等相關(guān)分子標志物表達;4)體外誘導(dǎo)hAMSCs成骨、成脂分化檢測其多向分化潛能。2.hAMSCs致瘤性檢測:1)體外將hAMSCs接種在雙層軟瓊脂上,觀察其集落形成情況,驗證其體外致瘤性;2)體內(nèi)將hAMSCs接種于NOD/SCID小鼠皮下及肌肉,檢測其體內(nèi)致瘤性。3.hAMSCs體內(nèi)移植改善T2D小鼠高血糖癥狀:1)利用高脂喂養(yǎng)聯(lián)合STZ注射構(gòu)建T2D小鼠模型;2)將hAMSCs(實驗組)或PBS(對照組)經(jīng)尾靜脈注射進入T2D小鼠體內(nèi),系統(tǒng)檢測實驗組和對照組小鼠隨機血糖、空腹血糖、糖耐量、胰島素耐量及血清中C-肽含量的變化;3)通過HE染色及免疫熒光染色檢測實驗組和對照組小鼠胰腺中胰島β細胞的形態(tài)及數(shù)目變化。4.hAMSCs體內(nèi)移植改善T2D小鼠高血糖癥狀的相關(guān)機制研究:1)通過HE染色檢測實驗組和對照組小鼠肝臟的形態(tài)及結(jié)構(gòu);2)PAS染色檢測hAMSCs對T2D小鼠肝臟組織糖原合成的影響;3)Q-PCR檢測hAMSCs對T2D小鼠肝臟糖酵解、糖異生的影響;4)Western Blot檢測hAMSCs改善T2D小鼠肝臟胰島素抵抗的相關(guān)信號通路蛋白的表達水平變化。結(jié)果:1.成功從人羊膜上分離、培養(yǎng)得到hAMSCs,RT-PCR、流式細胞術(shù)及免疫熒光檢測表明hAMSCs高表達胚胎干細胞標志基因Nanog、OCT4、SSEA-4及間充質(zhì)干細胞標志基因CD29、CD73、CD90、CD105。不表達造血干細胞標志基因CD34、CD45、CD133。低表達主要組織相容性Ⅰ類抗原HLA-ABC,不表達其共刺激分子CD80、CD86、CD40,不表達主要組織相容性Ⅱ類抗原HLADR。體外誘導(dǎo)實驗表明hAMSCs可成功分化為脂肪細胞及骨細胞,具有多分化潛能。2.體外雙層軟瓊脂實驗及體內(nèi)成瘤實驗表明hAMSCs在體外及體內(nèi)均無致瘤性;3.經(jīng)尾靜脈將hAMSCs移植進入T2D小鼠體內(nèi)可顯著降低小鼠隨機及空腹血糖、改善其糖耐量及胰島素耐量,且可部分重建T2D小鼠胰島形態(tài);4.進一步研究表明hAMSCs體內(nèi)移植后小鼠肝臟組織中肝損傷得到改善、糖原合成增加,糖異生相關(guān)基因PGC-1α、G6Pase表達下降,糖酵解相關(guān)基因LPK、PFK表達上升。另外,炎癥相關(guān)基因IL-1β、TNF-α表達顯著降低。Western Blot檢測表明,hAMSCs體內(nèi)移植可顯著提高T2D小鼠肝臟組織中胰島素敏感性相關(guān)蛋白p-IRS-1、GLUT4的表達,IGF-1R、p-IGF-1R、PI3K、AKT、p-AKT等表達也顯著上調(diào)。結(jié)論:hAMSCs表達間充質(zhì)干細胞及胚胎干細胞標志蛋白,具有分化潛能高、免疫原性低及安全無致瘤性等特點。hAMSCs體內(nèi)移植可降低T2D小鼠血糖,改善STZ及長期高糖引起的胰島損傷,降低T2D小鼠肝臟組織炎癥水平、抑制肝臟糖異生、促進肝臟糖酵解、提高肝臟胰島素敏感性。hAMSCs顯著改善T2D小鼠高血糖癥狀可能與其激活PI3K/AKT/INS信號通路有關(guān)。
【圖文】：

第 3 章 實驗結(jié)果3.1 hAMSCs 的分離、培養(yǎng)及鑒定首先，將新鮮羊膜組織從醫(yī)院取回，利用胰酶和膠原酶消化得到hAMSCs，培養(yǎng)hAMSCs至第3代，鏡下觀察其形態(tài)為成纖維狀細胞樣，形態(tài)如圖1A。RT-PCR及流式檢測結(jié)果表明hAMSCs高表達間充質(zhì)干細胞標志基因CD29、CD73、CD90、CD105。不表達造血干細胞標志基因CD34、CD45、CD133（圖1B、1C），低表達主要組織相容性Ⅰ類抗原HLA-ABC，但不表達其共刺激分子CD80、CD86、CD40，不表達主要組織相容性Ⅱ類抗原HLA-DR（圖1C、1D）；免疫熒光檢測結(jié)果表明hAMSCs高表達Nanog、OCT-4、SSEA-4胚胎干細胞標志物（圖1E）；另外在體外將hAMSCs成功定向誘導(dǎo)分化為脂肪細胞、骨細胞，證明其具有多項分化潛能（圖1F）。

第3章 實驗結(jié)果3.2 hAMSCs 致瘤性檢測分別通過體外雙層軟瓊脂集落形成實驗和體內(nèi)NOD/SCID小鼠皮下成瘤實驗鑒定hAMSCs的致瘤性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，hAMSCs不能在軟瓊脂上增殖、生長，，未行成集落，而對照組（hepG2組）形成肉眼可見的較大集落群（圖2A）體內(nèi)實驗結(jié)果表明在移植細胞兩個月后，hAMSCs組 NOD/SCID小鼠皮下未見腫瘤形成，而對照組（胚胎干細胞組）皮下可見明顯腫瘤形成（圖2B）。
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R587.1;R-332

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