【摘要】：背景和目的:糖尿病是位列心血管疾病和腫瘤之后的第三大嚴(yán)重危害人類健康的疾病,主要分為胰島素分泌缺陷的1型糖尿病和胰島素作用缺陷的2型糖尿病(Type 2diabetes,T2D)。目前臨床上對(duì)T2D的治療主要為使用口服降糖藥物或注射外源性胰島素,如果患者的高血糖沒有得到有效控制,則可導(dǎo)致進(jìn)行性的胰島β細(xì)胞損傷和糖尿病性腎衰、心臟病變、眼底病變、壞疽等并發(fā)癥。間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是一類具有自我復(fù)制和多向分化潛能的多能干細(xì)胞,具有免疫調(diào)節(jié)、抑制炎癥等特點(diǎn)。近年來,應(yīng)用MSCs治療T2D及其并發(fā)癥已成為糖尿病治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。與其他來源(如臍帶、骨髓、臍血等)的MSCs相比,人羊膜來源的MSCs(即人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞,Human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSCs)具有來源豐富、分離簡(jiǎn)單、增殖能力強(qiáng)、無致瘤性,低免疫原性及高組織相容性等優(yōu)點(diǎn)。本課題旨在系統(tǒng)研究hAMSCs的特征以及hAMSCs對(duì)T2D小鼠模型的治療作用及其可能的分子機(jī)制,以期為臨床上T2D的治療提供新的方法和手段。方法:1.hAMSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定:1)將羊膜從胎盤上分離,依次經(jīng)胰酶及膠原酶消化得到hAMSCs單細(xì)胞懸液;2)將分離得到的hAMSCs接種在10cm培養(yǎng)皿中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng);3)采用RT-PCR、流式細(xì)胞術(shù)及免疫熒光檢測(cè)hAMSCs間充質(zhì)干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞及免疫源性等相關(guān)分子標(biāo)志物表達(dá);4)體外誘導(dǎo)hAMSCs成骨、成脂分化檢測(cè)其多向分化潛能。2.hAMSCs致瘤性檢測(cè):1)體外將hAMSCs接種在雙層軟瓊脂上,觀察其集落形成情況,驗(yàn)證其體外致瘤性;2)體內(nèi)將hAMSCs接種于NOD/SCID小鼠皮下及肌肉,檢測(cè)其體內(nèi)致瘤性。3.hAMSCs體內(nèi)移植改善T2D小鼠高血糖癥狀:1)利用高脂喂養(yǎng)聯(lián)合STZ注射構(gòu)建T2D小鼠模型;2)將hAMSCs(實(shí)驗(yàn)組)或PBS(對(duì)照組)經(jīng)尾靜脈注射進(jìn)入T2D小鼠體內(nèi),系統(tǒng)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠隨機(jī)血糖、空腹血糖、糖耐量、胰島素耐量及血清中C-肽含量的變化;3)通過HE染色及免疫熒光染色檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠胰腺中胰島β細(xì)胞的形態(tài)及數(shù)目變化。4.hAMSCs體內(nèi)移植改善T2D小鼠高血糖癥狀的相關(guān)機(jī)制研究:1)通過HE染色檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠肝臟的形態(tài)及結(jié)構(gòu);2)PAS染色檢測(cè)hAMSCs對(duì)T2D小鼠肝臟組織糖原合成的影響;3)Q-PCR檢測(cè)hAMSCs對(duì)T2D小鼠肝臟糖酵解、糖異生的影響;4)Western Blot檢測(cè)hAMSCs改善T2D小鼠肝臟胰島素抵抗的相關(guān)信號(hào)通路蛋白的表達(dá)水平變化。結(jié)果:1.成功從人羊膜上分離、培養(yǎng)得到hAMSCs,RT-PCR、流式細(xì)胞術(shù)及免疫熒光檢測(cè)表明hAMSCs高表達(dá)胚胎干細(xì)胞標(biāo)志基因Nanog、OCT4、SSEA-4及間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志基因CD29、CD73、CD90、CD105。不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志基因CD34、CD45、CD133。低表達(dá)主要組織相容性Ⅰ類抗原HLA-ABC,不表達(dá)其共刺激分子CD80、CD86、CD40,不表達(dá)主要組織相容性Ⅱ類抗原HLADR。體外誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)表明hAMSCs可成功分化為脂肪細(xì)胞及骨細(xì)胞,具有多分化潛能。2.體外雙層軟瓊脂實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)表明hAMSCs在體外及體內(nèi)均無致瘤性;3.經(jīng)尾靜脈將hAMSCs移植進(jìn)入T2D小鼠體內(nèi)可顯著降低小鼠隨機(jī)及空腹血糖、改善其糖耐量及胰島素耐量,且可部分重建T2D小鼠胰島形態(tài);4.進(jìn)一步研究表明hAMSCs體內(nèi)移植后小鼠肝臟組織中肝損傷得到改善、糖原合成增加,糖異生相關(guān)基因PGC-1α、G6Pase表達(dá)下降,糖酵解相關(guān)基因LPK、PFK表達(dá)上升。另外,炎癥相關(guān)基因IL-1β、TNF-α表達(dá)顯著降低。Western Blot檢測(cè)表明,hAMSCs體內(nèi)移植可顯著提高T2D小鼠肝臟組織中胰島素敏感性相關(guān)蛋白p-IRS-1、GLUT4的表達(dá),IGF-1R、p-IGF-1R、PI3K、AKT、p-AKT等表達(dá)也顯著上調(diào)。結(jié)論:hAMSCs表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞及胚胎干細(xì)胞標(biāo)志蛋白,具有分化潛能高、免疫原性低及安全無致瘤性等特點(diǎn)。hAMSCs體內(nèi)移植可降低T2D小鼠血糖,改善STZ及長(zhǎng)期高糖引起的胰島損傷,降低T2D小鼠肝臟組織炎癥水平、抑制肝臟糖異生、促進(jìn)肝臟糖酵解、提高肝臟胰島素敏感性。hAMSCs顯著改善T2D小鼠高血糖癥狀可能與其激活PI3K/AKT/INS信號(hào)通路有關(guān)。
【圖文】：

第 3 章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1 hAMSCs 的分離、培養(yǎng)及鑒定首先，將新鮮羊膜組織從醫(yī)院取回，利用胰酶和膠原酶消化得到hAMSCs，培養(yǎng)hAMSCs至第3代，鏡下觀察其形態(tài)為成纖維狀細(xì)胞樣，形態(tài)如圖1A。RT-PCR及流式檢測(cè)結(jié)果表明hAMSCs高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志基因CD29、CD73、CD90、CD105。不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志基因CD34、CD45、CD133（圖1B、1C），低表達(dá)主要組織相容性Ⅰ類抗原HLA-ABC，但不表達(dá)其共刺激分子CD80、CD86、CD40，不表達(dá)主要組織相容性Ⅱ類抗原HLA-DR（圖1C、1D）；免疫熒光檢測(cè)結(jié)果表明hAMSCs高表達(dá)Nanog、OCT-4、SSEA-4胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物（圖1E）；另外在體外將hAMSCs成功定向誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞，證明其具有多項(xiàng)分化潛能（圖1F）。

第3章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.2 hAMSCs 致瘤性檢測(cè)分別通過體外雙層軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)NOD/SCID小鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)鑒定hAMSCs的致瘤性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，hAMSCs不能在軟瓊脂上增殖、生長(zhǎng)，，未行成集落，而對(duì)照組（hepG2組）形成肉眼可見的較大集落群（圖2A）體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在移植細(xì)胞兩個(gè)月后，hAMSCs組 NOD/SCID小鼠皮下未見腫瘤形成，而對(duì)照組（胚胎干細(xì)胞組）皮下可見明顯腫瘤形成（圖2B）。
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R587.1;R-332

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本文編號(hào)：2692224