【摘要】：目的:瘧疾是一類由按蚊作為傳播媒介的傳染性疾病。據(jù)報道2017年全球約有21900萬人感染瘧疾,約435000人死于瘧疾。惡性瘧原蟲是WHO非洲區(qū)域最流行的瘧疾寄生蟲,占2017年瘧疾病例的99.7%。然而,惡性瘧原蟲對所有的抗瘧藥均產(chǎn)生了不同程度的抗藥性。RTS,S疫苗作為目前最先進的瘧疾候選抗原,最近出現(xiàn)總體效率低的問題。因此,研制一種新型有效的抗瘧藥是消除惡性瘧原蟲的有力手段。近年來,ATG(autophagy-related proteins,ATG)作為自噬相關蛋白被認為是開發(fā)抗瘧新藥有希望的作用靶點,而ATG4(autophagy-related protein 4,ATG4)作為抗瘧靶點的研究尚無報道。自噬作用廣泛存在于大部分真核細胞中,是細胞降解胞內(nèi)蛋白及細胞器,保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的一種重要方式。同時也是溶酶體對自身結構的吞噬降解,是細胞內(nèi)的再循環(huán)系統(tǒng),有30多種不同類型的自噬相關蛋白(ATG)參與了這一過程。由于自噬對細胞內(nèi)的降解和生物合成過程具有重要作用,所以猜測在瘧原蟲的發(fā)育過程中它可能也發(fā)揮關鍵作用。ATG蛋白在包括酵母、植物和哺乳動物在內(nèi)的真核生物中高度保守,然而在原生生物中僅部分保守。新的實驗證據(jù)表明自噬在惡性瘧原蟲或弓形蟲等致病性寄生蟲的分化、發(fā)育和存活中的重要性。ATG8(autophagy-related protein 8,ATG8)是許多有機體中應用最廣泛的自噬體標記蛋白且被認為是寄生蟲存活必不可少的,并在發(fā)育的各階段均有表達。ATG4和ATG8同屬于ATG8綴合系統(tǒng),且ATG4對ATG8具有重要作用。因此,本研究擬在對ATG4蛋白生物信息學分析的基礎上,明確自噬相關蛋白ATG4在惡性瘧原蟲中的定位,從而為下一步ATG4在惡性瘧原蟲中相關功能的研究和抗瘧新藥的研發(fā)提供一定的理論基礎。研究方法:通過生物信息學分析Pf ATG4(PlasmoDB ID:PF3D7_1417300)蛋白包括結構域,信號肽,跨膜區(qū),進化樹及同源性等基礎信息;運用載體構建在原核表達系統(tǒng)中獲得PfATG4重組蛋白;通過免疫小鼠以獲得PfATG4重組蛋白的抗血清;通過酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測PfATG4重組蛋白的免疫原性;取不同培養(yǎng)時期的3D7蟲血涂片,經(jīng)吉姆薩染色處理后,在電子顯微鏡下觀察3D7各期形態(tài);利用間接免疫熒光實驗(IFA)和免疫印跡實驗(western blot)定位PfATG4蛋白的表達階段。結果:1.生物信息學分析表明Pf ATG4是一個無信號肽、無跨膜區(qū)的蛋白;含有l(wèi)ow complexity region、2個中央重復區(qū)和2個Pfam結構域。根據(jù)進化樹和同源比對發(fā)現(xiàn)ATG4在各種瘧原蟲中相對保守,在酵母中僅部分保守。2.通過載體構建得到純化后的PfATG4重組蛋白。3.成功獲得了PfATG4抗血清。4.與對照組相比,PfATG4重組蛋白的免疫血清水平有明顯升高;5.IFA及Western blot檢測發(fā)現(xiàn)PfATG4在環(huán)狀體、滋養(yǎng)體和裂殖體三個不同時期均有表達。結論:1.Pf ATG4重組蛋白具有良好的免疫原性。2.PfATG4表達在無性階段的環(huán)狀體、滋養(yǎng)體和裂殖體期。3.PfATG4為胞漿表達蛋白。
【圖文】：

3 結果.1 生物信息學分析經(jīng)生物信息學分析，惡性瘧原蟲 ATG4(ID: PF3D7_1417300)位于瘧原蟲第 14染色體 709670-713309 之間。全長包含 1124 個氨基酸，基因組 DNA 為 3640 bp。文選取 PfATG4 蛋白的 620-772aa（amino acid, aa）作為研究對象。利用 SMART件對 PfATG4 蛋白結構域預測，結果顯示 PfATG4 包含 low complexity region、2中央重復區(qū)和 2 個 Pfam 結構域（圖 1）；運用 Signalp 4.1server 預測信號肽，發(fā)現(xiàn)fATG4 不存在信號肽（圖 2）；TMHMM2.0 軟件對跨膜區(qū)預測發(fā)現(xiàn) PfATG4 無跨膜域（圖 3），預測 PfATG4 可能為胞漿表達。進化樹結果顯示 ATG4 在各種瘧原蟲屬中親緣關系較近（圖 4），同源序列比對可見 ATG4 蛋白在各種瘧原蟲中相對保，在酵母中僅部分保守（圖 5）。

PfATG4 蛋白的 620-772aa（amino acid, aa）作為研究對象。利用PfATG4 蛋白結構域預測，結果顯示 PfATG4 包含 low complexity r復區(qū)和 2 個 Pfam 結構域（圖 1）；運用 Signalp 4.1server 預測信號 不存在信號肽（圖 2）；TMHMM2.0 軟件對跨膜區(qū)預測發(fā)現(xiàn) PfATG 3），預測 PfATG4 可能為胞漿表達。進化樹結果顯示 ATG4 在各種緣關系較近（圖 4），，同源序列比對可見 ATG4 蛋白在各種瘧原蟲中母中僅部分保守（圖 5）。圖 1. PfATG4 蛋白結構域示意圖包含 1124 個氨基酸。其中紅色代表中央重復區(qū)，分別為 348-407aa，595-65m 區(qū)：即 Peptidase_C54 結構域，分別為 144-643aa，759-1088aa；灰色代表低
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R382.31

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本文編號：2689531