【摘要】：目的:瘧疾是一類由按蚊作為傳播媒介的傳染性疾病。據(jù)報道2017年全球約有21900萬人感染瘧疾,約435000人死于瘧疾。惡性瘧原蟲是WHO非洲區(qū)域最流行的瘧疾寄生蟲,占2017年瘧疾病例的99.7%。然而,惡性瘧原蟲對所有的抗瘧藥均產(chǎn)生了不同程度的抗藥性。RTS,S疫苗作為目前最先進(jìn)的瘧疾候選抗原,最近出現(xiàn)總體效率低的問題。因此,研制一種新型有效的抗瘧藥是消除惡性瘧原蟲的有力手段。近年來,ATG(autophagy-related proteins,ATG)作為自噬相關(guān)蛋白被認(rèn)為是開發(fā)抗瘧新藥有希望的作用靶點,而ATG4(autophagy-related protein 4,ATG4)作為抗瘧靶點的研究尚無報道。自噬作用廣泛存在于大部分真核細(xì)胞中,是細(xì)胞降解胞內(nèi)蛋白及細(xì)胞器,保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的一種重要方式。同時也是溶酶體對自身結(jié)構(gòu)的吞噬降解,是細(xì)胞內(nèi)的再循環(huán)系統(tǒng),有30多種不同類型的自噬相關(guān)蛋白(ATG)參與了這一過程。由于自噬對細(xì)胞內(nèi)的降解和生物合成過程具有重要作用,所以猜測在瘧原蟲的發(fā)育過程中它可能也發(fā)揮關(guān)鍵作用。ATG蛋白在包括酵母、植物和哺乳動物在內(nèi)的真核生物中高度保守,然而在原生生物中僅部分保守。新的實驗證據(jù)表明自噬在惡性瘧原蟲或弓形蟲等致病性寄生蟲的分化、發(fā)育和存活中的重要性。ATG8(autophagy-related protein 8,ATG8)是許多有機(jī)體中應(yīng)用最廣泛的自噬體標(biāo)記蛋白且被認(rèn)為是寄生蟲存活必不可少的,并在發(fā)育的各階段均有表達(dá)。ATG4和ATG8同屬于ATG8綴合系統(tǒng),且ATG4對ATG8具有重要作用。因此,本研究擬在對ATG4蛋白生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上,明確自噬相關(guān)蛋白ATG4在惡性瘧原蟲中的定位,從而為下一步ATG4在惡性瘧原蟲中相關(guān)功能的研究和抗瘧新藥的研發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。研究方法:通過生物信息學(xué)分析Pf ATG4(PlasmoDB ID:PF3D7_1417300)蛋白包括結(jié)構(gòu)域,信號肽,跨膜區(qū),進(jìn)化樹及同源性等基礎(chǔ)信息;運用載體構(gòu)建在原核表達(dá)系統(tǒng)中獲得PfATG4重組蛋白;通過免疫小鼠以獲得PfATG4重組蛋白的抗血清;通過酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測PfATG4重組蛋白的免疫原性;取不同培養(yǎng)時期的3D7蟲血涂片,經(jīng)吉姆薩染色處理后,在電子顯微鏡下觀察3D7各期形態(tài);利用間接免疫熒光實驗(IFA)和免疫印跡實驗(western blot)定位PfATG4蛋白的表達(dá)階段。結(jié)果:1.生物信息學(xué)分析表明Pf ATG4是一個無信號肽、無跨膜區(qū)的蛋白;含有l(wèi)ow complexity region、2個中央重復(fù)區(qū)和2個Pfam結(jié)構(gòu)域。根據(jù)進(jìn)化樹和同源比對發(fā)現(xiàn)ATG4在各種瘧原蟲中相對保守,在酵母中僅部分保守。2.通過載體構(gòu)建得到純化后的PfATG4重組蛋白。3.成功獲得了PfATG4抗血清。4.與對照組相比,PfATG4重組蛋白的免疫血清水平有明顯升高;5.IFA及Western blot檢測發(fā)現(xiàn)PfATG4在環(huán)狀體、滋養(yǎng)體和裂殖體三個不同時期均有表達(dá)。結(jié)論:1.Pf ATG4重組蛋白具有良好的免疫原性。2.PfATG4表達(dá)在無性階段的環(huán)狀體、滋養(yǎng)體和裂殖體期。3.PfATG4為胞漿表達(dá)蛋白。
【圖文】：

3 結(jié)果.1 生物信息學(xué)分析經(jīng)生物信息學(xué)分析，惡性瘧原蟲 ATG4(ID: PF3D7_1417300)位于瘧原蟲第 14染色體 709670-713309 之間。全長包含 1124 個氨基酸，基因組 DNA 為 3640 bp。文選取 PfATG4 蛋白的 620-772aa（amino acid, aa）作為研究對象。利用 SMART件對 PfATG4 蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測，結(jié)果顯示 PfATG4 包含 low complexity region、2中央重復(fù)區(qū)和 2 個 Pfam 結(jié)構(gòu)域（圖 1）；運用 Signalp 4.1server 預(yù)測信號肽，發(fā)現(xiàn)fATG4 不存在信號肽（圖 2）；TMHMM2.0 軟件對跨膜區(qū)預(yù)測發(fā)現(xiàn) PfATG4 無跨膜域（圖 3），預(yù)測 PfATG4 可能為胞漿表達(dá)。進(jìn)化樹結(jié)果顯示 ATG4 在各種瘧原蟲屬中親緣關(guān)系較近（圖 4），同源序列比對可見 ATG4 蛋白在各種瘧原蟲中相對保，在酵母中僅部分保守（圖 5）。

PfATG4 蛋白的 620-772aa（amino acid, aa）作為研究對象。利用PfATG4 蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測，結(jié)果顯示 PfATG4 包含 low complexity r復(fù)區(qū)和 2 個 Pfam 結(jié)構(gòu)域（圖 1）；運用 Signalp 4.1server 預(yù)測信號 不存在信號肽（圖 2）；TMHMM2.0 軟件對跨膜區(qū)預(yù)測發(fā)現(xiàn) PfATG 3），預(yù)測 PfATG4 可能為胞漿表達(dá)。進(jìn)化樹結(jié)果顯示 ATG4 在各種緣關(guān)系較近（圖 4），，同源序列比對可見 ATG4 蛋白在各種瘧原蟲中母中僅部分保守（圖 5）。圖 1. PfATG4 蛋白結(jié)構(gòu)域示意圖包含 1124 個氨基酸。其中紅色代表中央重復(fù)區(qū)，分別為 348-407aa，595-65m 區(qū)：即 Peptidase_C54 結(jié)構(gòu)域，分別為 144-643aa，759-1088aa；灰色代表低
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R382.31

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本文編號：2689531