【摘要】：接種疫苗是預(yù)防與控制病原體傳染最有效的方式。目前,盡管有些病原體進(jìn)入機體是通過黏膜系統(tǒng)進(jìn)入機體,但是絕大多數(shù)疫苗免疫方式為注射免疫。雖然該類免疫方式可以為機體提供一定保護(hù)效果,但是因其主要誘導(dǎo)機體中IgG抗體產(chǎn)生而不能有效刺激機體產(chǎn)生黏膜免疫反應(yīng),具有一定的局限性。而黏膜免疫不僅可以刺激機體產(chǎn)生有效的黏膜免疫應(yīng)答,誘導(dǎo)局部IgA抗體分泌,防止病原體通過黏膜感染或者入侵機體,還可以促進(jìn)機體產(chǎn)生細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答以及體液免疫應(yīng)答。另外,與傳統(tǒng)注射免疫相比,黏膜免疫方式具有更易被接種者接受、簡化接種程序、降低疫苗成本以及可以避免經(jīng)血液傳播傳染性疾病的交叉感染等優(yōu)勢。雖然黏膜免疫方式具有如此多的優(yōu)點,但是因其需要較大量的抗原以及抗原經(jīng)黏膜進(jìn)入機體需克服黏膜耐受等問題只有少數(shù)的黏膜免疫疫苗應(yīng)用于人類。佐劑因其對于增強免疫過程中免疫反應(yīng)至關(guān)重要而在疫苗研究中備受關(guān)注。然而,目前只有少數(shù)安全有效的疫苗佐劑應(yīng)用于人類疫苗,尤其是黏膜佐劑。因此,研制出一種有效、安全的黏膜免疫佐劑對于黏膜免疫疫苗的發(fā)展具有極為重要的意義。本研究在霍亂毒素A1亞基的基礎(chǔ)上,在其C末端連接金黃色葡萄球菌A蛋白人工類似物的二聚體(DD),后者是一種免疫球蛋白(Ig)結(jié)合片段,可將A1亞基靶向至B細(xì)胞受體以及免疫球蛋白,構(gòu)建融合蛋白CTA1-DD并對其作為黏膜佐劑效果評價研究。流感是由流感病毒引起的一種急性呼吸系統(tǒng)疾病,常常伴隨高燒、流鼻涕以及全身肌肉酸痛等癥狀,經(jīng)常造成流感爆發(fā)大流行以及季節(jié)性流感。據(jù)統(tǒng)計每年在季節(jié)性流行期間,全世界約10%-20%的人口會感染流感病毒,導(dǎo)致300萬-500萬嚴(yán)重病例以及29萬-65萬人死亡。流感病毒可以分為甲型流感病毒(A)、乙型流感病毒(B)、丙型流感病毒(C)以及丁型流感病毒(D)四類。除丁型流感病毒外都可感染人類引起流感,其中甲型流感病毒中的H1N1、H3N2以及H5N1等是引起流感大流行的主要病原體,因此對于該類病毒的預(yù)防與控制對人類公共衛(wèi)生事業(yè)具有極其重要的意義。甲型流感病毒是正粘病毒科流感病毒屬中單股負(fù)鏈RNA病毒,該病毒在傳播過程中常發(fā)生抗原轉(zhuǎn)變進(jìn)而引起新型流感爆發(fā)。雖然該病毒經(jīng)過呼吸道黏膜入侵機體,但是目前所有的滅活、裂解以及亞單位疫苗都是通過皮下或肌肉注射免疫的途徑接種。因此研究一種安全有效的黏膜免疫流感疫苗具有非常重要的意義。為此,本論文選用無毒的CTA1-DD作為黏膜佐劑并分別應(yīng)用于甲型流感病毒H1N1裂解疫苗以及H3N2裂解疫苗經(jīng)鼻腔免疫小鼠后對其效果進(jìn)行評價,本研究為CTA1-DD作為人類疫苗的新型黏膜佐劑奠定基礎(chǔ)。本研究首先利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)新型黏膜佐劑CTA1-DD蛋白,利用密碼子優(yōu)化、基因合成、酶切連接等技術(shù)將目的基因插入表達(dá)載體pET30a,成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET30a-CTA1-DD,然后將其轉(zhuǎn)入BL21(DE3)中表達(dá)。結(jié)果表明該蛋白即可可溶性表達(dá)又可以包涵體形式表達(dá),表達(dá)蛋白分子量約為36KD。為便于后期實驗利用,選用可溶性表達(dá)蛋白進(jìn)行純化。該蛋白經(jīng)陰離子交換、分子篩層析技術(shù)獲得純度高達(dá)98.43%、濃度2.4mg/ml的CTA1-DD蛋白。另外,將CTA1-DD佐劑蛋白分別與H1N1裂解亞單位成分以及H3N2裂解亞單位成分混合經(jīng)鼻腔免疫后觀察其免疫效果,并與常規(guī)氫氧化鋁佐劑聯(lián)合裂解亞單位成分經(jīng)肌肉注射免疫效果比較。動物實驗結(jié)果表明,與氫氧化鋁佐劑組相比,當(dāng)CTA1-DD與甲型流感裂解亞單位成分混合滴鼻免疫小鼠后可以顯著增強血清中特異性IgG抗體水平,同時促進(jìn)小鼠呼吸道以及陰道等黏膜處IgA的分泌與產(chǎn)生,這一結(jié)果提示CTA1-DD作為流感裂解疫苗的黏膜佐劑經(jīng)過鼻腔免疫不僅可以刺激機體產(chǎn)生有效的體液免疫應(yīng)答,還可以刺激機體產(chǎn)生黏膜免疫應(yīng)答;在氫氧化鋁佐劑聯(lián)合裂解亞單位成分肌肉注射后,血清中存在較高水平的IgG抗體,但在呼吸道以及陰道處未檢測到IgA抗體,提示了常規(guī)免疫方式可以有效激活體液免疫應(yīng)答,而不能刺激機體產(chǎn)生黏膜免疫應(yīng)答。此外,ELISPOT實驗以及血清中IgG亞型抗體水平證明,CTA1-DD聯(lián)合甲型流感裂解亞單位成分經(jīng)滴鼻免疫可以促進(jìn)分泌IFN-Υ的T淋巴細(xì)胞增殖以及降低IgG1/IgG2a 比值,這一結(jié)果揭示了 CTA1-DD可以有效激活體內(nèi)Th-1類細(xì)胞反應(yīng);而氫氧化鋁佐劑聯(lián)合裂解亞單位成分經(jīng)肌肉注射免疫可以促進(jìn)分泌IL-4的T淋巴細(xì)胞增殖以及提高IgGl/IgG2a 比值,這一結(jié)果顯示氫氧化鋁佐劑通過激活體內(nèi)Th-2類細(xì)胞反應(yīng)發(fā)揮作用。同時,HI效價檢測結(jié)果也證實CTA1-DD作為黏膜佐劑比氫氧化鋁佐劑具有更好的效果,可以刺激小鼠體內(nèi)產(chǎn)生更強的HI滴度。最后,為了評價CTA1-DD作為黏膜免疫佐劑的效果,對免疫后小鼠分別進(jìn)行致死劑量的活毒攻擊實驗。兩部分實驗均發(fā)現(xiàn)CTA1-DD混合裂解亞單位成分滴鼻免疫后可以提供100%的保護(hù)效果,并且極大地降低了發(fā)病率;而鋁佐劑混合H1N1裂解亞單位成分僅有66.67%的保護(hù)效果,混合H3N2裂解亞單位成分僅提供50%的保護(hù)效果,且兩部分實驗結(jié)果都發(fā)現(xiàn)鋁佐劑組伴隨著精神萎靡、毛發(fā)直立、食欲不振、消瘦以及行動遲緩等癥狀。綜上所述,本研究利用原核表達(dá)系統(tǒng),經(jīng)陰離子交換、分子篩層析獲得高純度CTA11-DD佐劑蛋白。CTA1-DD具有良好的黏膜佐劑活性,對滴鼻免疫裂解疫苗具有較好的免疫應(yīng)答輔助作用,不僅可以刺激機體產(chǎn)生系統(tǒng)免疫應(yīng)答和黏膜局部免疫應(yīng)答,還可以有效激活Th-1類細(xì)胞免疫應(yīng)答。總之,該佐劑可以作為預(yù)防呼吸道疾病和其他經(jīng)黏膜感染機體的病原體的黏膜佐劑進(jìn)一步探索。
【圖文】：

進(jìn)其可溶性表達(dá)，我們按照大腸桿菌偏好密碼子對目的基因的核苷酸序列優(yōu)化后逡逑合成。然后再利用其他的分子生物學(xué)技術(shù)，將目的基因插入表達(dá)載體ＰＥＴ３０ａ，逡逑并將該表達(dá)載體命名為ＰＥＴ３０ａ－ＣＴＡｌ－ＤＤ，具體構(gòu)建如下圖１．１：逡逑１４逡逑

ApET30a雙醉切結(jié)果
【學(xué)位授予單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R392

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本文編號：2689701