【摘要】：旋毛蟲病是一種食源性人獸共患寄生蟲病,主要是由于生食或半生食含囊包幼蟲的肉類所致。旋毛蟲可引起發(fā)熱、面部水腫、肌肉疼痛等多種臨床表現(xiàn),嚴重感染可因并發(fā)癥而死亡。幼蟲是旋毛蟲的主要致病階段,尋找幼蟲在侵入腸黏膜過程中起到關鍵作用的蛋白酶尤為重要,組織蛋白酶B是木瓜蛋白酶樣的半胱氨酸蛋白酶,前期研究發(fā)現(xiàn)組織蛋白酶B能夠降解宿主的黏連蛋白、纖連蛋白、Ⅰ型和Ⅳ型膠原蛋白,與寄生蟲的侵入與組織內移行有關,由此我們推測該蛋白可能參與了旋毛蟲入侵宿主。本研究克隆表達了旋毛蟲組織蛋白酶B(TsCB),并對其生物信息學性質進行了分析,利用純化后的重組TsCB(rTsCB)制備免疫血清,然后對TsCB進行免疫熒光定位、RT-PCR分析,并研究其與小鼠腸上皮細胞(IECs)的結合作用以及在侵入IECs中的功能,從而探究TsCB在旋毛蟲入侵宿主IECs的作用。材料與方法1.旋毛蟲蟲種、實驗動物、細胞及菌株本實驗所用旋毛蟲蟲種為河南南陽豬源地理株,實驗動物包括昆明小鼠、BABL/c小鼠,均購自河南省實驗動物中心,細胞為本實驗分離傳代得到的小鼠IECs,rTsCB表達菌株為BL21。2.TsCB生物信息學分析利用ExPasy網站對TsCB蛋白的基本理化性質進行預測分析;在SignalP 4.1 Server預測TsCB是否具有信號肽;在TMHMM網站預測TsCB蛋白跨膜結構;利用SWISS-MODEL網頁預測TsCB的二級結構和三級結構;在NCBI中找到TsCB(Tsp-03306)相關信息,預測其酶活性位點。使用BioEdit軟件,將旋毛蟲組織蛋白酶B與人、小鼠和其他寄生蟲的組織蛋白酶B進行序列比對和系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析。3.TsCB的克隆表達及抗原性分析將TsCB基因連接到表達載體pQE-80L,原核表達出重組蛋白rTsCB,經鎳柱親和純化后免疫小鼠制備小鼠抗rTsCB免疫血清,并收集ML粗抗原和ES抗原,進行SDS-PAGE和Western blot實驗,分析rTsCB的抗原性。4.TsCB在旋毛蟲各蟲期的表達及熒光免疫定位通過RT-PCR分析TsCB基因在不同蟲期[肌幼蟲(ML)、腸道感染性幼蟲(IIL)、成蟲(AW)、新生幼蟲(NBL)]的轉錄水平,收集不同蟲期的蟲體,將新鮮蟲體制成石蠟切片,進行IFA實驗檢測TsCB在旋毛蟲不同發(fā)育階段的表達及定位情況。5.TsCB與IECs的結合作用及其在旋毛蟲侵入IECs中的作用通過ELISA、Western blot、Far-Western和熒光共聚焦顯微鏡檢查,將TsCB與IECs孵育后檢測兩者結合情況,并通過分離的IECs胞漿與胞核,進一步驗證TsCB和IECs的相互作用。然后進行體外幼蟲侵入實驗,將IIL幼蟲加入DMEM半固體培養(yǎng)基中,覆蓋于IECs單層表面,在培養(yǎng)基中同時分別加入rTsCB和rTsCB免疫血清,孵育2h后鏡下觀察幼蟲對IECs的侵入。6.干擾TsCB基因的表達對IIL侵入IEC的阻斷作用設計小干擾RNA(siRNA 596),沉默TsCB在肌幼蟲的表達,確定siRNA 596干擾的最佳濃度和持續(xù)時間,將干擾后的ML進行體外侵入實驗,觀察沉默TsCB基因的表達對幼蟲侵入IEC的阻斷作用。7.rTsCB免疫小鼠誘導的免疫應答和免疫保護作用將30只BALB/c小鼠(雌性)隨機分成3組即rTsCB免疫組、佐劑組和PBS組,按每只小鼠20μg rTsCB蛋白皮下多點注射,間隔2周免疫,共免疫4次,末次免疫后每只小鼠經口感染300條ML,感染6d后,剖殺小鼠,收集腸道中的成蟲及培養(yǎng)后的新生幼蟲,計算成蟲減蟲率及新生幼蟲產量,并對蟲體體長進行測量,觀察形態(tài)變化。8.統(tǒng)計學處理使用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對本實驗中所有數(shù)據(jù)進行處理分析,數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差,根據(jù)實驗及數(shù)據(jù)的類型選擇統(tǒng)計學方法,包括卡方檢驗、單因素方差分析和t檢驗,檢驗水平為α0.05。結果1.TsCB生物信息學分析TsCB(accession No:NW_003526941.1)基因的生物信息學軟件及在線網站分析預測結果顯示,TsCB基因序列全長1071bp,編碼356個氨基酸,分子量約為40.23kDa,等電點為7.86。具有信號肽(1-29aa),N端有明顯的疏水區(qū),有1個跨膜區(qū)(12-35aa),存在有1個肽酶(peptidase_C1A)的結構功能域,位于102-351aa,定位于細胞膜外。TsCB二級結構包含有7個α-螺旋、13個β-折疊,三級結構預測有4個酶活性位點分別為:組氨酸(His)、谷氨酰胺(Gln)、半胱氨酸(Cys)、天冬酰胺(Asn),他們緊密排布于該蛋白分子空間結構中。2.TsCB的克隆表達及抗原性分析將TsCB基因連接到克隆載體pMD19-T中,雙酶切后將TsCB連接到表達載體pQE-80L,構建重組表達質粒pQE-80L/TsCB,轉入感受態(tài)細胞中,將陽性克隆菌進行測序鑒定,將連接成功的單菌落加2 mM IPTG,37℃誘導6h后收集菌體進行SDS-PAGE,發(fā)現(xiàn)pQE-80L/TsCB在39.7kDa處出現(xiàn)一條蛋白帶,可溶性分析顯示rTsCB以包涵體形式存在,將rTsCB免疫小鼠制備鼠抗rTsCB血清。Western blot分析顯示,純化后的rTsCB蛋白可被抗rTsCB血清識別,但不能被旋毛蟲感染小鼠血清識別,與正常小鼠血清無交叉反應;抗rTsCB血清可識別旋毛蟲不同期蟲體(ML,IIL,AW,NBL)粗抗原中天然的TsCB,但不能識別ES抗原中的TsCB,表明TsCB是旋毛蟲蟲體蛋白中的成份。3.TsCB在旋毛蟲各蟲期的表達及熒光免疫定位RT-PCR結果表明TsCB基因在旋毛蟲不同期蟲體(ML,IIL,AW,NBL)均有轉錄,蟲體切片免疫熒光顯示TsCB主要定位于蟲體桿狀體、皮層和雌成蟲的胚胎。4.間接ELISA檢測rTsCB與IECs的結合用不同濃度IECs包板,與10μg/mL rTsCB孵育后,ELISA結果表明IECs蛋白最佳包被濃度為3.2μg/mL。然后以此濃度包板,與不同濃度的rTsCB蛋白孵育,結果表明rTsCB濃度達到1.75μg/mL時,rTsCB與IEC蛋白充分結合。OD值隨著IEC包被濃度的增加而升高(F=298.187,P0.01),兩者具有相關性(r=0.743,P0.05);此外,OD值也隨著rTsCB孵育濃度的加大而增加(F=458.891,P0.01),二者也具有顯著相關性(r=0.953,P0.01),表明重組蛋白可以和IECs結合。5.Western blot分析rTsCB與IECs的特異性結合rTsCB與活的IECs孵育2h后,Western blot實驗顯示抗rTsCB免疫血清識別了7條IECs的蛋白帶,而感染血清識別了5條帶,正常血清不能識別。然而,抗rTsCB血清不能識別經BSA孵育后的IECs蛋白。將IECs胞漿蛋白和胞核蛋白分別與rTsCB孵育后進行的Western blot結果顯示,抗rTsCB血清分別識別5條胞漿蛋白帶和3條胞核蛋白帶,表明TsCB與IECs的結合位點是在IEC胞漿與胞核。6.Far western和IFA驗證rTsCB與IECs相互作用Far-Western結果顯示IECs蛋白能被抗rTsCB血清和旋毛蟲感染小鼠血清識別,但不能被正常小鼠血清識別;抗rTsCB血清能識別IEC全細胞蛋白中的8條帶,胞漿蛋白中的7條和胞核蛋白中6條帶,再次表明rTsCB能夠與IECs結合,共聚焦顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn),rTsCB能夠與IECs特異性結合,更加直觀形象的表明rTsCB能夠與IEC結合,結合部位在的IECs的胞漿與胞核。7.rTsCB與抗rTsCB血清對旋毛蟲體外侵入IECs的促進與抑制作用體外侵入結果表明,rTsCB對IIL幼蟲侵入IECs有顯著地促進作用,這種促進作用呈劑量依賴性(r=0.985,P0.01),且隨著抗rTsCB蛋白濃度的增加,促進侵入作用增強(F=341.596,P0.01),但BSA并無促進幼蟲入侵作用。將IIL加入IECs單層后幼蟲能夠侵入細胞單層。與PBS組相比較,抗rTsCB血清(1:100-1:600)能夠明顯抑制幼蟲的對IECs侵襲(P0.01)�？箁TsCB抗體的抑制作用呈劑量依賴性(r=0.974,P0.01),隨著血清稀釋度的增加呈下降趨勢(F=90.963,P0.01)。此外,小鼠免疫前血清和單佐劑免疫小鼠血清對幼蟲入侵無明顯的抑制作用。8.沉默TsCB基因對IIL侵入IECs的阻斷作用利用電穿孔法將不同終濃度的siRNA 596轉染旋毛蟲肌幼蟲,進行Western blot實驗,結果表明在siRNA 596濃度為1μM、1.5μM、2μM和2.5μM時,TsCB表達量分別被抑制了19.61%、41.35%、75.47%及72.38%。,因此siRNA 596濃度為2μM時的干擾效果最好。將2μM siRNA 596導入蟲體培養(yǎng)2天后TsCB蛋白表達量被抑制了89.49%。體外侵入實驗結果顯示,siRNA 596干擾組與PBS組相比,兩組幼蟲侵入率的差異有統(tǒng)計學意義(χ2=42.632,P0.01),沉默TsCB基因對幼蟲侵入IEC抑制率為49.96%。9.rTsCB誘導的免疫應答類型及免疫保護作用分析rTsCB免疫小鼠后,血清中IgG抗體明顯升高,在第2次免疫后,IgG1及IgG2a水平也明顯升高,但IgG1升高水平更為顯著(t_(4w)=4.350,t_(6w)=4.247,t_(8w)=2.902,P0.01),因而rTsCB免疫小鼠主要誘導的是Th2型免疫反應。rTsCB免疫小鼠攻蟲感染后6d,成蟲的減蟲率為52.81%,與PBS組相比差異顯著(F=63.80,P0.01),佐劑組與PBS組成蟲數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(F=8.4,P0.05)。對雌、雄成蟲的體長分別進行測量,結果表明與PBS組和佐劑組相比,rTsCB免疫組雌成蟲體長明顯變短(F=19.390,P0.01),而雄成蟲體長變化3組間無明顯差異(F=1.849,P0.05)。此外,rTsCB免疫組新生幼蟲產量與PBS組相比,明顯減少(F=11.153,P0.01),對新生幼蟲體長進行測量發(fā)現(xiàn),rTsCB免疫組新生幼蟲體長變短,與PBS組差異顯著。(F=24.788,P0.01)。結論1.成功構建了旋毛蟲組織蛋白酶B(TsCB)重組原核表達質粒PQE-80L/TsCB,并誘導表達出rTsCB;2.TsCB在旋毛蟲各個發(fā)育時期均有表達,主要定位于蟲體桿狀體、皮層和雌蟲的胚胎;3.rTsCB能夠與小鼠腸上皮細胞特異性結合,對旋毛蟲侵入腸上皮細胞有明顯的促進作用,而抗rTsCB血清能夠顯著抑制幼蟲對腸上皮細胞的侵入;沉默TsCB基因亦明顯抑制了旋毛蟲對小腸上皮細胞的侵入;rTsCB對小鼠具有較好的免疫保護作用。因此,TsCB是旋毛蟲侵入宿主腸上皮細胞的相關蛋白。
【圖文】：

疫保護作用性 BABL/c 小鼠進行攻蟲感染，每只小鼠灌胃 3后的新生幼蟲，并對其進行體長測量和計數(shù)，，結息學分析化性質和結構功能分析 旋毛蟲組織蛋白酶 B（c軟件及在線網站分析預測結果顯示，TsCB 基序列全長 1071bp，編碼 356 個氨基酸，分子量約號肽，位于 1-29aa（圖 1），N 端有明顯的疏水區(qū)有 1 個肽酶（peptidase_C1A）的結構功能域（圖 4蛋白可能為分泌蛋白（圖 5）。二級結構包含有 7）（圖 6、圖 7-a），三級結構預測有 4 個酶活性位點氨酰胺（Gln）、半胱氨酸（Cys）、天冬酰胺（Asn構中。

個肽酶（peptidase_C1A）的結構功能域（圖可能為分泌蛋白（圖 5）。二級結構包含有圖 6、圖 7-a），三級結構預測有 4 個酶活性胺（Gln）、半胱氨酸（Cys）、天冬酰胺（。圖 1 TsCB 信號肽預測TsCB 蛋白具有信號肽，位于 1-29aa 之間
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R383.15

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本文編號：2688049