【摘要】：目的:構(gòu)建源自人外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(Induced pluripotent stem cells,iPSCs),并鑒定構(gòu)建的細(xì)胞,為后期建立心血管疾病的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞庫(kù)奠定基礎(chǔ)。通過(guò)單層細(xì)胞分化法將iPSCs分化為血管平滑肌細(xì)胞(Vascular smooth cells,VSMCs),觀察分化過(guò)程中的相關(guān)變化,并對(duì)分化的細(xì)胞進(jìn)行鑒定,確�？煽啃�,為后續(xù)研究提供充足的研究材料。方法:分離PBMCs,并使用非整合質(zhì)粒電轉(zhuǎn)的方式構(gòu)建成iPSCs。通過(guò)光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、堿性磷酸酶染色(Alkaline phosphatase,AP)、細(xì)胞免疫熒光染色和體內(nèi)三胚層分化實(shí)驗(yàn)四種方法鑒定構(gòu)建的iPSCs。采用單層細(xì)胞法將誘導(dǎo)多能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為血管平滑肌細(xì)胞,并采用光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、鈣黃綠素染色、細(xì)胞免疫熒光染色、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,Q-PCR)方法鑒定分化出來(lái)的VSMCs。結(jié)果:1.成功分離并培養(yǎng)出PBMCs,采用非整合質(zhì)粒電轉(zhuǎn)的方法將PBMCs向iPSCs誘導(dǎo)。光鏡下,iPSCs呈現(xiàn)出與胚胎干細(xì)胞(Embryonic Stem Cells,ESCs)類(lèi)似的克隆樣生長(zhǎng)方式,呈大的圓形或橢圓形樣,邊緣整齊,細(xì)胞排列緊密;高倍鏡下細(xì)胞核大而圓,有一個(gè)至多個(gè)細(xì)胞核,胞漿較少。AP染色顯示誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性,表現(xiàn)為克隆中出現(xiàn)紫黑色顆粒。細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示所有iPSCs中Nanog,Sox2,Oct4,TRA-1-60均為強(qiáng)陽(yáng)性。體內(nèi)三胚層分化實(shí)驗(yàn)證實(shí)iPSCs可以向三個(gè)胚層的細(xì)胞成分分化,明確表明其具有多能性。2.對(duì)分化出來(lái)的iPSCs-VSMCs,在光鏡下可見(jiàn)細(xì)胞形態(tài)呈梭形,多角形,并對(duì)分化出來(lái)維持培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鈣黃綠素染色證明細(xì)胞存活。通過(guò)Q-PCR檢測(cè)構(gòu)建的iPSCs及iPSCs-VSMCs,iPSCs-VSMCs中α-SMA,CNN1,SM22α的mRNA水平顯著升高。進(jìn)行免疫熒光染色顯示分化出來(lái)的細(xì)胞在蛋白水平表達(dá)特異性標(biāo)記α-SMA,CNN1,SM22α。結(jié)論:由PBMCs進(jìn)行非整合質(zhì)粒電轉(zhuǎn)的方式成功構(gòu)建了iPSCs,其具有ESCs類(lèi)似的生長(zhǎng)方式,表達(dá)多潛能標(biāo)記并在體內(nèi)具向三個(gè)胚層的細(xì)胞分化潛能。單層細(xì)胞分化法是iPSCs向VSMCs分化的可靠方法,分化出的細(xì)胞長(zhǎng)期存活并與具有VSMCs相同的細(xì)胞形態(tài),表現(xiàn)出特異性標(biāo)記高表達(dá)。為組織工程血管構(gòu)建、再生醫(yī)學(xué)研究、疾病模型構(gòu)建、藥物篩選等研究奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

遵義醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文 郎正鵬2.結(jié)果2.1.iPSCs 的鑒定2.1.1 光鏡下觀察 iPSCs 的形態(tài)在 Matrigel 包被的培養(yǎng)皿中，，用 mTeSRTM1 維持培養(yǎng)的 iPSCs 呈現(xiàn)出與 ESCs 類(lèi)似的克隆樣生長(zhǎng)方式，克隆呈圓形或橢圓形，邊緣整齊，克隆內(nèi)部細(xì)胞排列緊密，克隆邊緣細(xì)胞稍疏松，表明細(xì)胞處于快速增殖狀態(tài)。如圖 1 所示

遵義醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文 郎正鵬2.1.2 堿性磷酸酶染色（Alkaline phosphatase，AP）AP 是原始未分化細(xì)胞的重要標(biāo)志之一，在胚胎干細(xì)胞中活性較高，目前也用于鑒定 iPSCs 具有干細(xì)胞特性的標(biāo)記。如圖 2 所示，患者 PBMCs 誘導(dǎo)產(chǎn)生的 iPSCs 中 AP染色呈強(qiáng)陽(yáng)性，表現(xiàn)為 iPSCs 克隆中出現(xiàn)紫色顆粒。
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R329.2

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本文編號(hào)：2684767