【摘要】：目的構(gòu)建銅綠假單胞菌重組Bb-OprH疫苗,研究疫苗免疫BALB/c鼠及PAO1株攻擊后誘導的保護力及其免疫機制。方法將PCR擴增的OprH基因克隆到pGEX-1λT中,得到重組質(zhì)粒pGEX-OprH;pGEX-OprH經(jīng)電穿孔轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21(DE3),SDA-PAGE分析重組菌表達的目的蛋白,Western blot用于鑒定其抗原性。將重組質(zhì)粒電穿孔至兩歧雙歧桿菌,SDS-PAGE及Western blot分析并鑒定表達產(chǎn)物。將構(gòu)建的重組Bb疫苗口服灌胃免疫BALB/c鼠,PAO1株攻擊后2周殺死小鼠,計數(shù)小鼠肺細菌負荷,ELISA用于測定血清抗體水平,并通過MTT檢測脾細胞增殖,流式細胞儀檢測脾細胞亞群及脾細胞凋亡,PCR測定脾細胞因子及Treg變化情況。結(jié)果通過PCR成功擴增出660 bp的OprH基因,PCR鑒定表明OprH基因成功克隆到pGEX-1λT中。重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21(DE3),SDS-PAGE表明重組菌可表達Mr約47 kDa的融合蛋白,Westen blot顯示融合蛋白可被Pa感染的鼠血清特異性識別。重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化兩歧雙歧桿菌,SDS-PAGE顯示重組菌可表達Mr約47 kDa的融合蛋白,Westen-blot顯示融合蛋白可被Pa感染的鼠血清特異性識別。重組Bb-OprH疫苗免疫及PAO1株攻擊后,疫苗組小鼠的肺細菌負荷下降,血清抗體IgG、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgE水平升高,脾細胞增殖增加,以CD4~+T細胞亞群為主,脾細胞凋亡減少,與對照組相比有顯著差異。重組疫苗組小鼠脾細胞中抽提的DNA經(jīng)PCR擴增得到脾細胞IL-2、IFN-γ、IL-12、IL-17及Foxp3基因片段,而對照組未擴增出相應的基因片段。結(jié)論重組Bb-OprH疫苗構(gòu)建成功,疫苗免疫可誘導小鼠產(chǎn)生保護性的體液及細胞免疫應答,增強小鼠對銅綠假單胞菌感染的抵抗力。
【圖文】：

marker; 1 - 4: PCR products of OprH圖 1 PCR 鑒定 OprH 基因擴增產(chǎn)物 Confirmation of PCR product of OpOprH 酶切鑒定Ⅰ對重組質(zhì)粒雙酶切，獲得 4947片段（圖 2）。M 1 2 3 4 5000000750000bp

arker; 1 - 4: PCR products of OprH g1 PCR 鑒定 OprH 基因擴增產(chǎn)物Confirmation of PCR product of OprHprH 酶切鑒定對重組質(zhì)粒雙酶切，，獲得 4947 bp段（圖 2）。M 1 2 3 4 5660p
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R392-33

【參考文獻】

相關期刊論文 前4條

1 劉祥;;銅綠假單胞菌外膜蛋白H原核表達、多克隆抗體制備及免疫保護作用[J];第二軍醫(yī)大學學報;2015年10期

2 譚建蓉;李文桂;覃婷;;日本血吸蟲重組Bb(pGEX-Sj32)疫苗免疫BALB/c小鼠誘導免疫應答的動態(tài)研究[J];中國人獸共患病學報;2015年09期

3 劉祥;陳春琳;王楊科;俱雄;吳三橋;張濤;;小鼠骨橋蛋白的原核表達及多克隆抗體的制備與鑒定[J];中國畜牧獸醫(yī);2015年05期

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本文編號：2684546