【摘要】：肥胖作為一種與糖尿病、心血管疾病、脂肪肝等發(fā)生密切相關(guān)的慢性代謝性疾病,因其高發(fā)病率和高危后果成為全球公共健康問(wèn)題。因此,如何預(yù)防及治療肥胖已成為研究熱點(diǎn)。Christensenella minuta(C.minuta)是一種嚴(yán)格厭氧的革蘭氏陰性腸道菌,已有研究表明其與體重減輕密切相關(guān),具有治療肥胖的潛在應(yīng)用價(jià)值。然而由于C.minuta的遺傳背景未知且難以在體外大量培養(yǎng),制約了對(duì)其進(jìn)行深入研究。因此,本論文通過(guò)第二代和第三代測(cè)序技術(shù)測(cè)定C.minuta全基因組序列,重點(diǎn)分析了C.minuta基因組中與安全性相關(guān)的遺傳信息,探究了C.minuta假定溶血素基因表達(dá)產(chǎn)物的溶血活性和其脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)毒性,初步闡明了C.minuta的遺傳信息和致病相關(guān)生理生化特性;針對(duì)該菌難培養(yǎng)的特性,對(duì)其培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化,通過(guò)體外培養(yǎng)能夠高效獲得大量C.minuta活菌。這不僅為C.minuta微生物學(xué)研究奠定了基礎(chǔ),還為今后C.minuta益生菌制劑的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供了思路。本論文得出的主要結(jié)論如下:通過(guò)第二代和第三代測(cè)序技術(shù)測(cè)定了C.minuta全基因組序列,其基因組大小為2,969,292 bp,平均GC含量為51.44%,含有3053個(gè)基因,67個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列,36個(gè)小衛(wèi)星序列,9個(gè)微衛(wèi)星序列,49個(gè)tRNA,6個(gè)rRNA和1個(gè)sRNA。對(duì)C.minuta基因組中與安全性相關(guān)的遺傳信息進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),C.minuta基因組中不含有與病原菌致病性和耐藥性相關(guān)的基因島和前噬菌體,含有12個(gè)不易轉(zhuǎn)移的耐藥基因、10個(gè)或許不能成功表達(dá)或產(chǎn)物活性極低的有害代謝產(chǎn)物相關(guān)基因、1個(gè)假定溶血素基因及部分內(nèi)毒素LPS合成基因。通過(guò)大腸肝菌表達(dá)系統(tǒng)制備了假定溶血素蛋白,分別檢測(cè)假定溶血素蛋白及C.minuta菌株溶血活性,發(fā)現(xiàn)菌株和蛋白均未在血平板上形成溶血環(huán),說(shuō)明該假定溶血素基因表達(dá)產(chǎn)物無(wú)溶血活性,C.minuta也無(wú)溶血性。通過(guò)SDS-PAGE電泳銀染法比較了C.minuta LPS與致病性大腸桿菌LPS的結(jié)構(gòu),結(jié)果發(fā)現(xiàn)C.minuta LPS僅顯示18 kDa、20-28 kDa和33 kDa三個(gè)條帶,明顯不同于致病性大腸桿菌LPS的典型階梯狀指紋條帶結(jié)構(gòu)。隨后體外細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果表明,與致病性大腸桿菌LPS相比,C.minuta LPS不能有效激活RAW 264.7巨噬細(xì)胞,誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和吞噬、核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活化以及炎癥介質(zhì)(TNF-α、IL-6、IL-1β、NO和活性氧)合成的能力很低,因此認(rèn)為C.minuta LPS毒性弱甚至無(wú)毒。通過(guò)單因素試驗(yàn)法和響應(yīng)面法對(duì)PYG(peptone-yeast extract-glucose)培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化,獲得C.minuta菌體生長(zhǎng)的最佳培養(yǎng)基:果糖5.41 g/L,牛肉提取物63.21 g/L,L-半胱氨酸鹽酸鹽1.90 g/L,MgSO_4 0.032 g/L,K_2HPO_4 0.16 g/L,NaHCO_3 1.6 g/L。C.minuta在此優(yōu)化培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí),活菌數(shù)可達(dá)8.15×10~(10) cfu/mL,比PYG培養(yǎng)基的活菌數(shù)提高48.22倍。
【圖文】：

圖 2-1 C. minuta 基因組 DNA 電泳結(jié)果 DNAMarker；1-12：C. minuta 基因組 DNA；M2：1 Fig. 2-1 The electrophoresis of C. minuta genomic DNt DNAMarker; 1-12: C. minuta genomic DNA; M2: 1 kb C. minuta 基因組樣品（圖 2-1）進(jìn)行 Qubit Fl別為 256 ng/μL、278 ng/μL，兩份樣品總量為 3時(shí)用NanoDrop分光光度計(jì)檢測(cè)得出OD260/OD 2.07、2.05，表明樣品未有 RNA、蛋白質(zhì)或酚文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序。基因組基本特征 和 Illumina Hiseq 2500 測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝，獲

華南理工大學(xué)碩士學(xué)位論文噬菌體；具體信息見(jiàn)表 2-2�；驆u和前噬菌體是由水平基因轉(zhuǎn)移形成的一段具有特定功能的 DNA 片段，眾多致病菌的毒力因子和耐藥性基本由其產(chǎn)生。如化膿鏈球菌 M1T1 含有能編碼 SpeA2 和Sad1 兩種毒力因子的前噬菌體，，增強(qiáng)了 M1T1 菌株的適應(yīng)性和毒性[58]；沙門(mén)氏菌的 1型基因島可介導(dǎo)對(duì)氨芐西林、鏈霉素、氯霉素、四環(huán)素和磺胺類(lèi)藥物等多種抗生素耐藥，使菌株的耐藥譜加寬、耐藥性增強(qiáng)[59]。C. minuta 不含有這兩種基因組件，說(shuō)明該菌的致病性或耐藥性可能較弱。
【學(xué)位授予單位】：華南理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R371

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2682706