【摘要】：肥胖作為一種與糖尿病、心血管疾病、脂肪肝等發(fā)生密切相關的慢性代謝性疾病,因其高發(fā)病率和高危后果成為全球公共健康問題。因此,如何預防及治療肥胖已成為研究熱點。Christensenella minuta(C.minuta)是一種嚴格厭氧的革蘭氏陰性腸道菌,已有研究表明其與體重減輕密切相關,具有治療肥胖的潛在應用價值。然而由于C.minuta的遺傳背景未知且難以在體外大量培養(yǎng),制約了對其進行深入研究。因此,本論文通過第二代和第三代測序技術測定C.minuta全基因組序列,重點分析了C.minuta基因組中與安全性相關的遺傳信息,探究了C.minuta假定溶血素基因表達產(chǎn)物的溶血活性和其脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)毒性,初步闡明了C.minuta的遺傳信息和致病相關生理生化特性;針對該菌難培養(yǎng)的特性,對其培養(yǎng)基進行了優(yōu)化,通過體外培養(yǎng)能夠高效獲得大量C.minuta活菌。這不僅為C.minuta微生物學研究奠定了基礎,還為今后C.minuta益生菌制劑的開發(fā)和應用提供了思路。本論文得出的主要結論如下:通過第二代和第三代測序技術測定了C.minuta全基因組序列,其基因組大小為2,969,292 bp,平均GC含量為51.44%,含有3053個基因,67個串聯(lián)重復序列,36個小衛(wèi)星序列,9個微衛(wèi)星序列,49個tRNA,6個rRNA和1個sRNA。對C.minuta基因組中與安全性相關的遺傳信息進行分析發(fā)現(xiàn),C.minuta基因組中不含有與病原菌致病性和耐藥性相關的基因島和前噬菌體,含有12個不易轉(zhuǎn)移的耐藥基因、10個或許不能成功表達或產(chǎn)物活性極低的有害代謝產(chǎn)物相關基因、1個假定溶血素基因及部分內(nèi)毒素LPS合成基因。通過大腸肝菌表達系統(tǒng)制備了假定溶血素蛋白,分別檢測假定溶血素蛋白及C.minuta菌株溶血活性,發(fā)現(xiàn)菌株和蛋白均未在血平板上形成溶血環(huán),說明該假定溶血素基因表達產(chǎn)物無溶血活性,C.minuta也無溶血性。通過SDS-PAGE電泳銀染法比較了C.minuta LPS與致病性大腸桿菌LPS的結構,結果發(fā)現(xiàn)C.minuta LPS僅顯示18 kDa、20-28 kDa和33 kDa三個條帶,明顯不同于致病性大腸桿菌LPS的典型階梯狀指紋條帶結構。隨后體外細胞試驗結果表明,與致病性大腸桿菌LPS相比,C.minuta LPS不能有效激活RAW 264.7巨噬細胞,誘導細胞增殖和吞噬、核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活化以及炎癥介質(zhì)(TNF-α、IL-6、IL-1β、NO和活性氧)合成的能力很低,因此認為C.minuta LPS毒性弱甚至無毒。通過單因素試驗法和響應面法對PYG(peptone-yeast extract-glucose)培養(yǎng)基進行優(yōu)化,獲得C.minuta菌體生長的最佳培養(yǎng)基:果糖5.41 g/L,牛肉提取物63.21 g/L,L-半胱氨酸鹽酸鹽1.90 g/L,MgSO_4 0.032 g/L,K_2HPO_4 0.16 g/L,NaHCO_3 1.6 g/L。C.minuta在此優(yōu)化培養(yǎng)基中培養(yǎng)時,活菌數(shù)可達8.15×10~(10) cfu/mL,比PYG培養(yǎng)基的活菌數(shù)提高48.22倍。
【圖文】：

圖 2-1 C. minuta 基因組 DNA 電泳結果 DNAMarker；1-12：C. minuta 基因組 DNA；M2：1 Fig. 2-1 The electrophoresis of C. minuta genomic DNt DNAMarker; 1-12: C. minuta genomic DNA; M2: 1 kb C. minuta 基因組樣品（圖 2-1）進行 Qubit Fl別為 256 ng/μL、278 ng/μL，兩份樣品總量為 3時用NanoDrop分光光度計檢測得出OD260/OD 2.07、2.05，表明樣品未有 RNA、蛋白質(zhì)或酚文庫構建和測序�；蚪M基本特征 和 Illumina Hiseq 2500 測序數(shù)據(jù)進行組裝，獲

華南理工大學碩士學位論文噬菌體；具體信息見表 2-2�；驆u和前噬菌體是由水平基因轉(zhuǎn)移形成的一段具有特定功能的 DNA 片段，眾多致病菌的毒力因子和耐藥性基本由其產(chǎn)生。如化膿鏈球菌 M1T1 含有能編碼 SpeA2 和Sad1 兩種毒力因子的前噬菌體，，增強了 M1T1 菌株的適應性和毒性[58]；沙門氏菌的 1型基因島可介導對氨芐西林、鏈霉素、氯霉素、四環(huán)素和磺胺類藥物等多種抗生素耐藥，使菌株的耐藥譜加寬、耐藥性增強[59]。C. minuta 不含有這兩種基因組件，說明該菌的致病性或耐藥性可能較弱。
【學位授予單位】：華南理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R371

【參考文獻】

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本文編號：2682706