【摘要】：研究背景:骨骼肌是人體健康的基礎(chǔ),也是人體體力活動(dòng)和運(yùn)動(dòng)能力的保障。肌肉萎縮一直困繞人類健康的難題,骨骼肌的萎縮不僅給患者本身的治療帶來麻煩,還會(huì)給社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)。既往研究證實(shí):骨骼肌的萎縮與失神經(jīng)、營養(yǎng)不良、廢用以及惡病質(zhì)如:癌癥、糖尿病、年齡老化、腎病、心力衰竭和慢性阻塞性肺病(COPD)、敗血癥、重度燒傷等有關(guān)。通過對(duì)糖尿病病人的骨骼肌萎縮進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn):交感神經(jīng)調(diào)節(jié)的異�？梢鹛悄虿�,同時(shí)糖尿病又常伴有交感神經(jīng)損害。這些結(jié)果暗示:交感神經(jīng)調(diào)節(jié)的異�？赡芘c骨骼肌的萎縮也有關(guān)系。但是相關(guān)方面的研究卻很少。但實(shí)際上,骨骼肌本身,除了受運(yùn)動(dòng)神經(jīng)支配外,骨骼肌血管還受交感舒血管神經(jīng)支配,而在交感舒血管神經(jīng)興奮時(shí),發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的主要神經(jīng)遞質(zhì)是乙酰膽堿。但乙酰膽堿是否參與了骨骼肌干細(xì)胞增殖、分化過程,從而影響骨骼肌的自我更新或修復(fù),尚不明確。研究目的:探索乙酰膽堿在骨骼肌干細(xì)胞分化中作用及其與去甲腎上腺素調(diào)節(jié)骨骼肌干細(xì)胞分化的關(guān)聯(lián)機(jī)制。研究方法:以小鼠C2C12細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料,建立2%馬血清培養(yǎng)基誘導(dǎo)其分化形成肌管,利用免疫熒光、RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)正常C2C12細(xì)胞毒蕈堿樣型受體(m AchRs)不同亞型的表達(dá)情況;采用CCK8法評(píng)價(jià)不同濃度乙酰膽堿對(duì)C2C12細(xì)胞增殖的影響;利用免疫熒光及QPCR法檢測(cè)C2C12細(xì)胞分化為快肌和慢肌的肌纖維類型以及相關(guān)的肌細(xì)胞生成蛋白(Myogenin,Myog)、生肌調(diào)節(jié)因子Myod和Myf5等調(diào)控因子的表達(dá);利用Ach,或Kpc1過表達(dá)/敲低的腺病毒轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞,采用上述類似方法和指標(biāo)觀察其在去甲腎上腺素介導(dǎo)的C2C12細(xì)胞分化中的作用。研究結(jié)果:(1).免疫熒光、QPCR和蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示:M1,M2,M3,M4,M5等mAchRs亞型在C2C12細(xì)胞均有表達(dá),且M2-AchR表達(dá)量最高,M3-AchR表達(dá)量最低。(2).CCK8結(jié)果顯示:不同濃度梯度的乙酰膽堿對(duì)C2C12細(xì)胞增殖無明顯影響。QPCR和免疫熒光結(jié)果顯示:低濃度乙酰膽堿對(duì)C2C12細(xì)胞分化有促進(jìn)作用,但高濃度的乙酰膽堿能夠抑制C2C12細(xì)胞分化。QPCR和免疫熒光結(jié)果顯示:低濃度乙酰膽堿對(duì)C2C12細(xì)胞纖維類型的改變無明顯影響,但高濃度的乙酰膽堿能抑制C2C12細(xì)胞快肌纖維和慢肌纖維的形成。(3).光鏡及QPCR和免疫熒光染色發(fā)現(xiàn):與對(duì)照組相比,Ach組和NE組肌管形成的量均有所減少,但NE組減少的更加明顯;Ach聯(lián)合NE組肌管雖與對(duì)照組相比也發(fā)生了減少,但比單一的Ach組或NE組要高;與對(duì)照組相比,單一的Ach組或者NE組,快慢肌纖維均有一定程度的減少,但以慢肌纖維的減少最為明顯,NE組慢肌纖維減少的程度大于Ach組,Ach聯(lián)合NE組與對(duì)照組相比,快慢肌纖維也有所減少,但比NE組要高。(4).光鏡下發(fā)現(xiàn):Ad-Kpc1組肌管分化與對(duì)照組相比有所增加,而Ad-shKpc1組與對(duì)照組相比有所減少,Ad-Kpc1+NE組與NE組相比有所增加。而Ad-shKpc1+NE組與NE組相比有所減少,但并不顯著;QPCR和免疫熒光染色顯示:Ad-Kpc1組快慢肌纖維與對(duì)照組相比均有所增加,且以慢肌纖維增加為主,而Ad-shKpc1組快慢肌纖維與對(duì)照組相比均有所減少,也以慢肌纖維減少為主。Ad-Kpc1+NE組與NE組相比快慢肌纖維均有所增加,而Ad-shKpc1+NE組與NE組相比快慢肌纖維均有所減少,且慢肌纖維減少的程度比快肌纖維更顯著。研究結(jié)論:(1).Ach低濃度時(shí)主要通過與C2C12細(xì)胞上M2受體結(jié)合而利于C2C12細(xì)胞分化,但在Ach高濃度時(shí)抑制了C2C12細(xì)胞分化,且以慢肌纖維減少最為明顯;(2).NE抑制了C2C12細(xì)胞分化,快慢肌纖維均減少,且以慢肌纖維減少最為明顯;(3).Ach能部分逆轉(zhuǎn)NE所介導(dǎo)的C2C12細(xì)胞分化抑制效應(yīng);(4).Kpc1能促進(jìn)C2C12細(xì)胞分化,并有效取消了NE所介導(dǎo)的C2C12細(xì)胞分化抑制效應(yīng)。
【圖文】：

結(jié)果2C12 細(xì)胞培養(yǎng)及免疫熒光鑒定傳至第三代后，在光鏡下觀察 C2C12 細(xì)胞在增殖期的形態(tài)(見用含有 2%馬血清的分化培養(yǎng)基，，進(jìn)行 C2C12 細(xì)胞的誘導(dǎo)分化 后，經(jīng)光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，可見 C2C12 細(xì)胞已經(jīng)形成典型的肌隨后對(duì) C2C12 細(xì)胞分化的標(biāo)志物 MYH 和 Myog 進(jìn)行免疫熒光12 細(xì)胞呈現(xiàn)明顯肌管形成和 MYH 和 Myog 強(qiáng)陽性表達(dá)，進(jìn)細(xì)胞已分化為肌細(xì)胞(見圖 1.1C 和圖 1.1D)。

結(jié)果2C12 細(xì)胞培養(yǎng)及免疫熒光鑒定傳至第三代后，在光鏡下觀察 C2C12 細(xì)胞在增殖期的形態(tài)(見用含有 2%馬血清的分化培養(yǎng)基，進(jìn)行 C2C12 細(xì)胞的誘導(dǎo)分化 后，經(jīng)光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，可見 C2C12 細(xì)胞已經(jīng)形成典型的肌隨后對(duì) C2C12 細(xì)胞分化的標(biāo)志物 MYH 和 Myog 進(jìn)行免疫熒光12 細(xì)胞呈現(xiàn)明顯肌管形成和 MYH 和 Myog 強(qiáng)陽性表達(dá)，進(jìn)細(xì)胞已分化為肌細(xì)胞(見圖 1.1C 和圖 1.1D)。
【學(xué)位授予單位】：湖北醫(yī)藥學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R329.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 韓云;吳愛民;陳燕;周紅;;卵巢癌細(xì)胞中RNF123對(duì)p27~(Kip1)蛋白穩(wěn)定性的調(diào)控作用[J];南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2015年05期

2 吳愛民;韓云;陳燕;周紅;;KPC1和胞質(zhì)p27~(Kip1)在上皮性卵巢癌中的表達(dá)及臨床意義[J];江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2013年05期

3 朱宇旌;于治姣;張勇;李艷;邵彩梅;;FoxO轉(zhuǎn)錄因子的活性調(diào)控及其對(duì)骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)節(jié)[J];動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào);2013年04期

本文編號(hào)：2682335