【摘要】：背景:支氣管哮喘是由多種炎癥細胞共同參與的以慢性氣道炎癥和氣道高反應為特征的疾病。哮喘的發(fā)病機制復雜,臨床分型多樣,以過敏性哮喘最為常見,大多數(shù)兒童以及50%的成年人哮喘均屬于過敏性哮喘。目前認為過敏性哮喘是由Th2細胞和ILC2細胞所介導,以呼吸道2型細胞因子(IL-4,IL-5和IL-13)水平增高、杯狀細胞化生及黏液分泌、嗜酸粒細胞浸潤以及血清Ig E水平增高等作為典型表現(xiàn)的氣道炎癥反應。維生素D是人體必需的一種脂溶性維生素,不僅可調(diào)節(jié)鈣磷代謝和促進骨骼發(fā)育,亦可通過與受體結合調(diào)節(jié)免疫細胞的功能。維生素D在哮喘中的研究尚存在爭議,這些結果的不一致性提示,維生素D發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的功能與其干預的時間和干預劑量、以及機體年齡和遺傳背景等因素相關。為確定維生素D干預在過敏性哮喘中的作用,我們在本研究中建立OVA誘導的BALB/c和C57BL/6新生鼠/成年鼠過敏性哮喘模型,分別在致敏期和激發(fā)期給予具有生物活性的維生素D代謝產(chǎn)物1,25(OH)2VD3(以下簡稱VD),觀察VD干預的劑量、時相對不同品系、不同年齡小鼠OVA誘導的過敏性炎癥反應的影響,并進一步探討其作用機制,為維生素D應用于過敏性哮喘的防治提供實驗依據(jù)。目的:1.研究VD干預的劑量、時相對不同品系、不同年齡小鼠OVA誘導的過敏性反應的影響;2.探討VD干預的可能機制。方法:1.OVA誘導的過敏性哮喘模型的建立:應用C57BL/6或BALB/c新生鼠(≤7天)及成年鼠(6-8周),造模分為致敏階段和激發(fā)階段。致敏階段于第0天和第7天經(jīng)腹腔注射OVA與氫氧化鋁佐劑的混懸液(含有10μg OVA和2mg Alum的50μl生理鹽水),成年鼠劑量加倍;激發(fā)階段于第14天開始連續(xù)6天霧化1%OVA溶液,每天霧化30min,對照組霧化相同時間生理鹽水;2.實驗分組及VD干預方案:實驗分為四組:對照組(Saline/saline),哮喘組(OVA/OVA),VD致敏期干預組(VD/OVA/OVA)和VD激發(fā)期干預組(OVA/VD/OVA)。VD致敏期干預組小鼠在兩次致敏前一天(-1天和第6天)腹腔注射1,25(OH)2VD3;VD激發(fā)期干預組小鼠在第13天和第16天腹腔注射1,25(OH)2VD3。依據(jù)參考文獻,將VD干預劑量定為5ng/g,之后根據(jù)實驗結果進行調(diào)整;3.檢測VD干預對不同品系及不同鼠齡動物過敏性炎癥反應的影響,最后一次霧化24h后收集樣本。肺組織經(jīng)膠原酶D消化后制備單細胞懸液,采用流式細胞術(flow cytometry,FCM)檢測肺臟嗜酸粒細胞的浸潤;肺組織切片進行高碘酸希夫染色(periodic Acid-Schiff stain,PAS)及蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-sosin staining,HE),觀察杯狀細胞化生及炎性細胞浸潤;ELISA檢測支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)或支氣管旁淋巴結(Peribronchial lymph node,PBLN)細胞培養(yǎng)上清中細胞因子IL-4、IL-5、IL-13、IFN-γ、IL-10以及IL-17A水平以及血清中Ig E、Ig G1和Ig G2a水平;4.探討VD干預的可能機制:采用FCM檢測肺臟免疫細胞,包括Th細胞、效應T細胞、Treg、樹突狀細胞(dendritic cell,DC)亞群及ILC2細胞的組成;ELISA檢測肺勻漿及BALF中上皮細胞來源細胞因子包括CCL-20、GM-CSF及IL-33的水平。5.探討致敏期VD干預在新生鼠模型中發(fā)揮保護作用的機制:B6新生鼠于第二次OVA致敏48h后處死,收集小鼠PBLN,采用FCM檢測PBLN中DC和T細胞的變化;在第二次致敏2h后收集小鼠腹腔灌洗液,ELISA檢測上清中的尿酸水平。結果:1.在BALB/c小鼠哮喘模型中,新生鼠和成年鼠經(jīng)OVA激發(fā)BALF中均出現(xiàn)大量嗜酸粒細胞的浸潤,呼吸道杯狀細胞化生及黏液分泌增加,肺組織血管及呼吸道周圍大量炎性細胞浸潤。當給予BALB/c小鼠參考劑量5ng/g VD干預時,無論是致敏期或激發(fā)期進行VD干預均使小鼠體重大幅下降,與對照組相比有顯著性差異。當VD劑量調(diào)整為2ng/g時,小鼠體重維持在正常水平,且此時在兩年齡組小鼠中不同階段VD干預均可明顯抑制過敏性炎癥反應;2.在C57BL/6(B6)小鼠哮喘模型中,新生鼠和成年鼠經(jīng)OVA激發(fā)后均出現(xiàn)過敏性炎癥反應。當給予2ng/g VD進行干預后其VD干預的效果與BALB/c小鼠并不一致。新生鼠致敏期VD干預可明顯緩解BALF和肺臟中嗜酸性粒細胞的浸潤,而激發(fā)期VD干預則無保護作用。成年鼠致敏期VD干預并不影響肺臟嗜酸粒細胞的浸潤,而激發(fā)期VD干預非但沒有保護作用,反而誘導了更為嚴重的嗜酸粒細胞浸潤(p0.01)。肺組織切片染色結果在兩年齡組小鼠中也呈現(xiàn)同樣的趨勢;3.已經(jīng)發(fā)現(xiàn),維生素D缺乏的兒童患哮喘的風險會大大增加。另外,考慮到后續(xù)機制研究需應用基因缺陷鼠多為B6背景,為此本課題中我們聚焦于VD干預在B6新生鼠模型中的作用。綜合上述實驗結果,我們將VD干預的工作劑量調(diào)整為4ng/g,此劑量不影響B(tài)6小鼠體重和健康狀態(tài)。B6新生鼠經(jīng)OVA激發(fā)后出現(xiàn)典型過敏性炎癥反應,表現(xiàn)為BALF和肺臟中均出現(xiàn)大量嗜酸粒細胞的浸潤,并伴隨中性粒細胞和淋巴細胞等炎性細胞的增多,有顯著性差異;呼吸道上皮有大量PAS染色陽性的杯狀細胞化生以及黏液分泌,BALF中Th2相關細胞因子(IL-4、IL-5和IL-13)水平均明顯升高以及血清Ig E水平增高,有顯著性差異。而致敏期或激發(fā)期VD干預均可緩解過敏性炎癥反應;4.相比于OVA/OVA組,PBLN培養(yǎng)上清中Th2相關細胞因子IL-4,IL-5及IL-13的水平在VD干預后均明顯降低,肺臟中IL-4+,IL-5+和IL-13+CD4+T細胞數(shù)目亦大幅減少。Treg在各組之間無統(tǒng)計學差異。另外致敏期VD干預可明顯減少肺臟效應T細胞數(shù)目(p0.05),且抑制PBLN中T細胞的活化,激發(fā)期干預則無影響;5.相比于OVA/OVA組,致敏期VD干預明顯減少肺臟中CD11b+DC的數(shù)目(p0.05),激發(fā)期干預無影響。此外VD干預組小鼠于OVA第2次致敏48h后檢測發(fā)現(xiàn)其PBLN中CD11b+DC的數(shù)目減少,其表面共刺激分子CD86及OX40L表達下降。致敏期或激發(fā)期VD干預均可明顯降低肺勻漿和BALF中CCL20的水平,而對GM-CSF水平則無影響;6.致敏期或激發(fā)期VD干預均能明顯減少OVA引起的ILC2細胞在肺部的集聚(p0.05)及其分泌IL-5和IL-13的水平。相比于OVA/OVA組,兩階段VD干預均可明顯降低肺勻漿中IL-33的水平,有顯著性差異。激發(fā)期VD干預還可降低BALF中IL-33的水平;7.致敏期腹腔注射OVA和氫氧化鋁佐劑的混懸液可引起腹腔尿酸水平的升高(p0.05),致敏期VD干預后可明顯降低腹腔尿酸的水平(p0.05)。結論:1.VD干預的劑量和時相、小鼠的遺傳背景和年齡均可影響VD干預的效果;2.VD干預可明顯減少肺臟中CD11b+DC的數(shù)目并降低其表面共刺激分子的表達,從而抑制T細胞的活化與分化;VD干預可明顯抑制上皮細胞分泌IL-33,減少ILC2細胞在肺部的集聚及其分泌細胞因子的水平;3.VD干預可明顯降低OVA和氫氧化鋁佐劑致敏引起的腹腔尿酸水平的增高,這是VD在致敏期發(fā)揮保護作用的重要機制。
【圖文】：

圖 1. 過敏性哮喘模型的建立及 VD 干預方案表 1.實驗分組實驗分組 處理方式新生鼠/成年鼠陰性對照組 Saline/Saline哮喘組 OVA/OVA

15圖 3. 同等劑量 VD 干預在 C57BL/6 小鼠模型中顯示不同的效果A，，B：VD 干預劑量為 2ng/g，F(xiàn)CM 檢測新生鼠 BALF 和肺臟中嗜酸性粒細胞等各種炎性細胞的浸潤。C，D：流式檢測成年鼠 BALF 和肺臟中嗜酸性細胞等各種炎性細胞的浸潤。E，F(xiàn)：新生鼠和成年鼠肺組織切片 H&E 和 PAS 染色
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R562.25;R-332

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本文編號：2681827