【摘要】：背景:支氣管哮喘是由多種炎癥細(xì)胞共同參與的以慢性氣道炎癥和氣道高反應(yīng)為特征的疾病。哮喘的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,臨床分型多樣,以過(guò)敏性哮喘最為常見(jiàn),大多數(shù)兒童以及50%的成年人哮喘均屬于過(guò)敏性哮喘。目前認(rèn)為過(guò)敏性哮喘是由Th2細(xì)胞和ILC2細(xì)胞所介導(dǎo),以呼吸道2型細(xì)胞因子(IL-4,IL-5和IL-13)水平增高、杯狀細(xì)胞化生及黏液分泌、嗜酸粒細(xì)胞浸潤(rùn)以及血清Ig E水平增高等作為典型表現(xiàn)的氣道炎癥反應(yīng)。維生素D是人體必需的一種脂溶性維生素,不僅可調(diào)節(jié)鈣磷代謝和促進(jìn)骨骼發(fā)育,亦可通過(guò)與受體結(jié)合調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能。維生素D在哮喘中的研究尚存在爭(zhēng)議,這些結(jié)果的不一致性提示,維生素D發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的功能與其干預(yù)的時(shí)間和干預(yù)劑量、以及機(jī)體年齡和遺傳背景等因素相關(guān)。為確定維生素D干預(yù)在過(guò)敏性哮喘中的作用,我們?cè)诒狙芯恐薪VA誘導(dǎo)的BALB/c和C57BL/6新生鼠/成年鼠過(guò)敏性哮喘模型,分別在致敏期和激發(fā)期給予具有生物活性的維生素D代謝產(chǎn)物1,25(OH)2VD3(以下簡(jiǎn)稱VD),觀察VD干預(yù)的劑量、時(shí)相對(duì)不同品系、不同年齡小鼠OVA誘導(dǎo)的過(guò)敏性炎癥反應(yīng)的影響,并進(jìn)一步探討其作用機(jī)制,為維生素D應(yīng)用于過(guò)敏性哮喘的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。目的:1.研究VD干預(yù)的劑量、時(shí)相對(duì)不同品系、不同年齡小鼠OVA誘導(dǎo)的過(guò)敏性反應(yīng)的影響;2.探討VD干預(yù)的可能機(jī)制。方法:1.OVA誘導(dǎo)的過(guò)敏性哮喘模型的建立:應(yīng)用C57BL/6或BALB/c新生鼠(≤7天)及成年鼠(6-8周),造模分為致敏階段和激發(fā)階段。致敏階段于第0天和第7天經(jīng)腹腔注射OVA與氫氧化鋁佐劑的混懸液(含有10μg OVA和2mg Alum的50μl生理鹽水),成年鼠劑量加倍;激發(fā)階段于第14天開(kāi)始連續(xù)6天霧化1%OVA溶液,每天霧化30min,對(duì)照組霧化相同時(shí)間生理鹽水;2.實(shí)驗(yàn)分組及VD干預(yù)方案:實(shí)驗(yàn)分為四組:對(duì)照組(Saline/saline),哮喘組(OVA/OVA),VD致敏期干預(yù)組(VD/OVA/OVA)和VD激發(fā)期干預(yù)組(OVA/VD/OVA)。VD致敏期干預(yù)組小鼠在兩次致敏前一天(-1天和第6天)腹腔注射1,25(OH)2VD3;VD激發(fā)期干預(yù)組小鼠在第13天和第16天腹腔注射1,25(OH)2VD3。依據(jù)參考文獻(xiàn),將VD干預(yù)劑量定為5ng/g,之后根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行調(diào)整;3.檢測(cè)VD干預(yù)對(duì)不同品系及不同鼠齡動(dòng)物過(guò)敏性炎癥反應(yīng)的影響,最后一次霧化24h后收集樣本。肺組織經(jīng)膠原酶D消化后制備單細(xì)胞懸液,采用流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry,FCM)檢測(cè)肺臟嗜酸粒細(xì)胞的浸潤(rùn);肺組織切片進(jìn)行高碘酸希夫染色(periodic Acid-Schiff stain,PAS)及蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-sosin staining,HE),觀察杯狀細(xì)胞化生及炎性細(xì)胞浸潤(rùn);ELISA檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)或支氣管旁淋巴結(jié)(Peribronchial lymph node,PBLN)細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-13、IFN-γ、IL-10以及IL-17A水平以及血清中Ig E、Ig G1和Ig G2a水平;4.探討VD干預(yù)的可能機(jī)制:采用FCM檢測(cè)肺臟免疫細(xì)胞,包括Th細(xì)胞、效應(yīng)T細(xì)胞、Treg、樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC)亞群及ILC2細(xì)胞的組成;ELISA檢測(cè)肺勻漿及BALF中上皮細(xì)胞來(lái)源細(xì)胞因子包括CCL-20、GM-CSF及IL-33的水平。5.探討致敏期VD干預(yù)在新生鼠模型中發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制:B6新生鼠于第二次OVA致敏48h后處死,收集小鼠PBLN,采用FCM檢測(cè)PBLN中DC和T細(xì)胞的變化;在第二次致敏2h后收集小鼠腹腔灌洗液,ELISA檢測(cè)上清中的尿酸水平。結(jié)果:1.在BALB/c小鼠哮喘模型中,新生鼠和成年鼠經(jīng)OVA激發(fā)BALF中均出現(xiàn)大量嗜酸粒細(xì)胞的浸潤(rùn),呼吸道杯狀細(xì)胞化生及黏液分泌增加,肺組織血管及呼吸道周圍大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。當(dāng)給予BALB/c小鼠參考劑量5ng/g VD干預(yù)時(shí),無(wú)論是致敏期或激發(fā)期進(jìn)行VD干預(yù)均使小鼠體重大幅下降,與對(duì)照組相比有顯著性差異。當(dāng)VD劑量調(diào)整為2ng/g時(shí),小鼠體重維持在正常水平,且此時(shí)在兩年齡組小鼠中不同階段VD干預(yù)均可明顯抑制過(guò)敏性炎癥反應(yīng);2.在C57BL/6(B6)小鼠哮喘模型中,新生鼠和成年鼠經(jīng)OVA激發(fā)后均出現(xiàn)過(guò)敏性炎癥反應(yīng)。當(dāng)給予2ng/g VD進(jìn)行干預(yù)后其VD干預(yù)的效果與BALB/c小鼠并不一致。新生鼠致敏期VD干預(yù)可明顯緩解BALF和肺臟中嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤(rùn),而激發(fā)期VD干預(yù)則無(wú)保護(hù)作用。成年鼠致敏期VD干預(yù)并不影響肺臟嗜酸粒細(xì)胞的浸潤(rùn),而激發(fā)期VD干預(yù)非但沒(méi)有保護(hù)作用,反而誘導(dǎo)了更為嚴(yán)重的嗜酸粒細(xì)胞浸潤(rùn)(p0.01)。肺組織切片染色結(jié)果在兩年齡組小鼠中也呈現(xiàn)同樣的趨勢(shì);3.已經(jīng)發(fā)現(xiàn),維生素D缺乏的兒童患哮喘的風(fēng)險(xiǎn)會(huì)大大增加。另外,考慮到后續(xù)機(jī)制研究需應(yīng)用基因缺陷鼠多為B6背景,為此本課題中我們聚焦于VD干預(yù)在B6新生鼠模型中的作用。綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們將VD干預(yù)的工作劑量調(diào)整為4ng/g,此劑量不影響B(tài)6小鼠體重和健康狀態(tài)。B6新生鼠經(jīng)OVA激發(fā)后出現(xiàn)典型過(guò)敏性炎癥反應(yīng),表現(xiàn)為BALF和肺臟中均出現(xiàn)大量嗜酸粒細(xì)胞的浸潤(rùn),并伴隨中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞的增多,有顯著性差異;呼吸道上皮有大量PAS染色陽(yáng)性的杯狀細(xì)胞化生以及黏液分泌,BALF中Th2相關(guān)細(xì)胞因子(IL-4、IL-5和IL-13)水平均明顯升高以及血清Ig E水平增高,有顯著性差異。而致敏期或激發(fā)期VD干預(yù)均可緩解過(guò)敏性炎癥反應(yīng);4.相比于OVA/OVA組,PBLN培養(yǎng)上清中Th2相關(guān)細(xì)胞因子IL-4,IL-5及IL-13的水平在VD干預(yù)后均明顯降低,肺臟中IL-4+,IL-5+和IL-13+CD4+T細(xì)胞數(shù)目亦大幅減少。Treg在各組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。另外致敏期VD干預(yù)可明顯減少肺臟效應(yīng)T細(xì)胞數(shù)目(p0.05),且抑制PBLN中T細(xì)胞的活化,激發(fā)期干預(yù)則無(wú)影響;5.相比于OVA/OVA組,致敏期VD干預(yù)明顯減少肺臟中CD11b+DC的數(shù)目(p0.05),激發(fā)期干預(yù)無(wú)影響。此外VD干預(yù)組小鼠于OVA第2次致敏48h后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其PBLN中CD11b+DC的數(shù)目減少,其表面共刺激分子CD86及OX40L表達(dá)下降。致敏期或激發(fā)期VD干預(yù)均可明顯降低肺勻漿和BALF中CCL20的水平,而對(duì)GM-CSF水平則無(wú)影響;6.致敏期或激發(fā)期VD干預(yù)均能明顯減少OVA引起的ILC2細(xì)胞在肺部的集聚(p0.05)及其分泌IL-5和IL-13的水平。相比于OVA/OVA組,兩階段VD干預(yù)均可明顯降低肺勻漿中IL-33的水平,有顯著性差異。激發(fā)期VD干預(yù)還可降低BALF中IL-33的水平;7.致敏期腹腔注射OVA和氫氧化鋁佐劑的混懸液可引起腹腔尿酸水平的升高(p0.05),致敏期VD干預(yù)后可明顯降低腹腔尿酸的水平(p0.05)。結(jié)論:1.VD干預(yù)的劑量和時(shí)相、小鼠的遺傳背景和年齡均可影響VD干預(yù)的效果;2.VD干預(yù)可明顯減少肺臟中CD11b+DC的數(shù)目并降低其表面共刺激分子的表達(dá),從而抑制T細(xì)胞的活化與分化;VD干預(yù)可明顯抑制上皮細(xì)胞分泌IL-33,減少ILC2細(xì)胞在肺部的集聚及其分泌細(xì)胞因子的水平;3.VD干預(yù)可明顯降低OVA和氫氧化鋁佐劑致敏引起的腹腔尿酸水平的增高,這是VD在致敏期發(fā)揮保護(hù)作用的重要機(jī)制。
【圖文】：

圖 1. 過(guò)敏性哮喘模型的建立及 VD 干預(yù)方案表 1.實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)分組 處理方式新生鼠/成年鼠陰性對(duì)照組 Saline/Saline哮喘組 OVA/OVA

15圖 3. 同等劑量 VD 干預(yù)在 C57BL/6 小鼠模型中顯示不同的效果A，，B：VD 干預(yù)劑量為 2ng/g，F(xiàn)CM 檢測(cè)新生鼠 BALF 和肺臟中嗜酸性粒細(xì)胞等各種炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)。C，D：流式檢測(cè)成年鼠 BALF 和肺臟中嗜酸性細(xì)胞等各種炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)。E，F(xiàn)：新生鼠和成年鼠肺組織切片 H&E 和 PAS 染色
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R562.25;R-332

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本文編號(hào)：2681827