【摘要】：在細胞膜上形成不同類型的孔,可導(dǎo)致不同類型的細胞死亡,其深刻地影響細胞的命運和疾病狀態(tài)。細胞毒性淋巴細胞和自然殺傷細胞可通過分泌穿孔素在細胞膜上成孔來介導(dǎo)病毒感染的細胞或腫瘤細胞死亡。脂多糖等細菌毒素可誘導(dǎo)GSDMD發(fā)生剪切,在細胞膜上成孔來誘導(dǎo)細胞發(fā)生焦亡。發(fā)生焦亡的細胞會釋放大量炎性內(nèi)容物,引起炎癥級聯(lián)反應(yīng),過度的細胞焦亡可導(dǎo)致各種免疫性疾病甚至發(fā)生感染性休克。然而,迄今為止,這些細胞膜上的孔的結(jié)構(gòu)和形態(tài)從未真正被觀察到。最近研究表明,原子力顯微鏡(atomic force microscope,AFM)是分析生物分子和細胞結(jié)構(gòu)性質(zhì)的有力工具。AFM可達到原子分辨率的水平來觀察生物樣品的表面粗糙度。因此我們使用AFM來清晰地顯示不同原因造成的細胞膜孔結(jié)構(gòu)。我們使用293T細胞進行真核重組表達人PFR,并將其用于處理OVA-B16黑色素腫瘤細胞。處理15分鐘后,為了方便觀察,使用4%多聚甲醛固定細胞,并通過AFM掃描成像進行觀察,在OVA-B16黑色素腫瘤細胞膜表面發(fā)現(xiàn)了形成的孔洞。應(yīng)用細菌來源的一種毒素,鏈球菌溶血素O來處理OVA-B16黑色素腫瘤細胞也發(fā)現(xiàn)了清晰的孔洞,但AFM成像顯示PFR在細胞膜上成孔的直徑明顯比鏈球菌溶血素O大。此外我們使用AFM成像發(fā)現(xiàn),細胞膜表面的孔洞形成具有時間依賴性,細胞膜表面隨著處理時間的延長,孔洞的數(shù)量直徑也在相應(yīng)增加。使用AFM進一步觀察到細胞通過某種方式自我修復(fù)了由鏈球菌溶血素O在細胞膜上形成的孔洞。人胚腎細胞293T細胞系中和人乳腺癌MC7-F細胞系中過表達焦亡的執(zhí)行分子GSDMD,通過AFM觀察發(fā)現(xiàn)細胞膜上均有孔洞的形成。有研究表明補體通過在細胞膜上成孔來殺滅病原菌,在本研究中,AFM成像為補體介導(dǎo)的細胞膜表面成孔提供了有力的可視化證據(jù)。AFM這種可視化不僅清晰的顯示了不同因素形成的細胞膜孔洞的孔徑和深度的區(qū)別,而且發(fā)現(xiàn)了細胞膜孔洞的形成具有時間依賴性。AFM這種類型的可視化生動地揭示了細胞膜孔形成,融合和修復(fù)的動態(tài)過程,為之后對細胞成孔的研究提供了有力的支持。
【圖文】：

圖１使用ＡＦＭ觀察ＳＬＯ邋／ＰＦＲ誘導(dǎo)的孔形成。（ａ）分別用ＰＢＳ或ＰＦＲ邋（５０Ｕ）ＯＶＡ－Ｂ１６細胞系１５ｍｉｎ，然后用ＰＢＳ洗滌細胞兩次之后在原子力顯微鏡下成像觀察。ｂ－ｇ首先分別用分離自活化的人ＣＤｒＴ細胞的ＳＬＯ或ＰＦＲ邋（５０Ｕ）ＯＶＡ－Ｂ１６細胞系（１Ｘ１０５）邋５分鐘，并用４％多聚甲醛固定，用ＡＦＭ成像。（胞系被固定后，在ＡＦＭ下成像。（ｃ）細胞膜的３Ｄ拓撲圖（ｄ）基于高分辨率

我們研究了邋ＳＬＯ誘導(dǎo)孔洞形成的動態(tài)過程。用濃度５０Ｕ的ＳＬＯ處理逡逑ＯＶＡ－Ｂ１６黑色素腫瘤細胞１０分鐘或３０分鐘時，孔洞開始形成，并且孔洞的數(shù)目逡逑X椉櫻ㄍ跡玻幔孀糯硎奔淶難映�，细胞膜钡a嬉蒼嚼叢醬植冢ㄍ跡玻猓獗礤義廈骺錐吹男緯曬淌薔哂惺奔湟覽敵�。此外＿b幔遙窈停遙恚幔鬧迪嚶Φ卦黽櫻ㄍ煎義希玻悖�。处理时紲Z難映げ喚鍪瓜赴ど峽錐吹氖吭黽櫻赴ど匣鉤魷至撕芏嘀卞義暇督洗蟮目錐矗ㄍ跡玻洌澹�。芯暽较大的垮F純贍芄橐蠐諦】椎娜諍希⑶遙櫻蹋峽贍蓯瑰義嫌媚持趾愣Ｊ皆諳赴ぶ諧中緯煽�。晤U怯茫擔埃斟澹櫻蹋洗恚希鄭粒攏保逗諫刂族義狹魷赴氖奔潿文�，并将将ＰＩ加入上清液中，通过ＰＩ进入细胞的扰f懇越徊藉義現(xiàn)な悼錐蔥緯墑且桓鍪奔湟覽敵怨獺Ｎ頤塹難芯拷峁⑾鄭校墑賈找允奔湟覽檔膩義戲絞澆耄希鄭粒攏保逗諫刂琢魷赴＃櫻蹋霞尤耄捶種又�，ＰＩ可以进入细胞进欣C義先舊＃櫻蹋霞尤耄保胺種又�，，蠟�(zāi)黽恿訟赴校校扇舊那慷齲す夤簿勱瓜暈㈠義暇檔慕峁土魘較赴塹慕峁捕賈っ髁爍媒峁ㄍ跡玻

本文編號：2679555