【摘要】：背景:弓形蟲(Toxoplasma gondii)是一種細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲,可感染人類和其他溫血?jiǎng)游?感染后可以經(jīng)血液迅速散播到所有組織器官。弓形蟲的感染刺激免疫細(xì)胞快速產(chǎn)生IL-12和IFNγ。外泌體是由細(xì)胞釋放的細(xì)胞外囊泡的一種亞群,粒徑大小在30-150nm之間,在細(xì)胞間的通訊中起著重要作用。在外泌體中,已經(jīng)檢測(cè)到蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、mRNA或miRNA的特定大分子。外泌體在被靶細(xì)胞攝取后,其本身富集的成分會(huì)對(duì)靶細(xì)胞產(chǎn)生影響,起到對(duì)靶細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用。樹突狀細(xì)胞(Dendritic Cells,DC)是免疫細(xì)胞的一種,是功能最強(qiáng)的專職抗原遞呈細(xì)胞(Antigen Presenting Cells,APC),它能高效地?cái)z取、加工處理和遞呈抗原。未成熟DC具有較強(qiáng)的遷移能力,成熟DC能有效激活初始T細(xì)胞,在免疫系統(tǒng)中有著不可或缺的作用,處于啟動(dòng)、調(diào)控、并維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)。MicroRNA(miRNA)是一類長度約20-24個(gè)核苷酸的小RNA,參與調(diào)控基因表達(dá)并且能夠參與生命過程中一系列的重要進(jìn)程,包括早期發(fā)育,細(xì)胞增殖,細(xì)胞凋亡和死亡。方法:體外培養(yǎng)收集RH株弓形蟲速殖子,并感染DC2.4細(xì)胞(MOI=3)28小時(shí)。收集未感染組樹突狀細(xì)胞外泌體(DC-EXO)、感染弓形蟲組樹突狀細(xì)胞外泌體(Tg-DC-EXO),并提取外泌體總RNA,進(jìn)而采用高通量測(cè)序的方法對(duì)兩組細(xì)胞外泌體進(jìn)行miRNA表達(dá)譜分析,分析來自這兩個(gè)細(xì)胞群的外泌體中差異表達(dá)的miRNA。分析這些miRNA的靶基因,并對(duì)靶基因進(jìn)行GO(Gene ontology)富集和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)途徑分析。結(jié)果:應(yīng)用DEGseq對(duì)基于測(cè)序的差異基因進(jìn)行檢測(cè),通過多重假設(shè)檢驗(yàn)校正,對(duì)于符合差異在兩倍及以上且Q-value值小于等于0.001,認(rèn)為是顯著的差異表達(dá)基因,總共獲得3,434個(gè)差異表達(dá)的miRNA,并從中篩選出差異顯著且穩(wěn)定的19個(gè)miRNA。這些差異表達(dá)的miRNA對(duì)應(yīng)的靶基因涉及多種生物過程和途徑,與免疫系統(tǒng)進(jìn)程和細(xì)胞生長以及細(xì)胞間通訊相關(guān)。結(jié)論:弓形蟲感染DC2.4后,導(dǎo)致細(xì)胞外泌體中富集的miRNA譜發(fā)生變化,而這些變化的miRNA與免疫系統(tǒng)的進(jìn)程有著關(guān)聯(lián),特別是T細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路,這使得這些差異表達(dá)的miRNA在研究免疫系統(tǒng)對(duì)弓形蟲感染所產(chǎn)生的反應(yīng)上顯得至關(guān)重要,也說明這些miRNA有作為檢測(cè)或預(yù)后靶標(biāo)的潛力。
【圖文】：

圖１外泌體ｍｉＲＮＡ的高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析流程逡逑２．３．２差異表達(dá)ｍｉＲＮＡ的篩選方法逡逑ＲＮＡ測(cè)序是一個(gè)隨機(jī)的過程，每一條序列都是均勻隨機(jī)的來自各自的樣品。逡逑因此可以認(rèn)為每一個(gè)基因的表達(dá)量服從二項(xiàng)分布或者泊松分布。首先我們根據(jù)逡逑二項(xiàng)分布來評(píng)估，而每個(gè)基因的ｐ值可以用Ｑｖａｌｕｅ進(jìn)行多重假設(shè)檢驗(yàn)校正，對(duì)逡逑于符合差異在兩倍及以上且Ｑ－ｖａｌｕｅ值小于等于０．００１，認(rèn)為是顯著的差異表達(dá)逡逑基因。我們的實(shí)驗(yàn)設(shè)置了多個(gè)重復(fù)，考慮到目前的研究情況，傳統(tǒng)的ＲＮＡ－ｓｅｑ逡逑１８逡逑

況先進(jìn)行弓形蟲的感染實(shí)驗(yàn)，采用ＲＨ－ＧＦＰ綠色熒光的弓形蟲蟲株對(duì)樹突狀細(xì)逡逑胞ＤＣ２．４進(jìn)行感染復(fù)數(shù)為３的弓形蟲感染實(shí)驗(yàn)，來判斷弓形蟲ＲＨ蟲株對(duì)樹突逡逑狀細(xì)胞ＤＣ２．４的侵襲效率。從圖１中我們可以看到在感染復(fù)數(shù)為３的情況，基逡逑本上每個(gè)樹突狀細(xì)胞都有弓形蟲速殖子入侵。逡逑Ｂｒｉｇｈｔ邐ＧＦＰ邐Ｍｅｒｇｅ逡逑—逡逑圖１用ＲＨ－ＧＦＰ感染評(píng)估弓形蟲ＲＨ蟲株對(duì)ＤＣ２．４的侵襲效率（ＭＯＩ＝３邋Ｘ４０本文使用ＧＦＰ－ＲＨ來評(píng)估弓形蟲ＲＨ株對(duì)ＤＣ２．４細(xì)胞的侵襲效率。以感染復(fù)數(shù)（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ逡逑ｏｆ邋Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，邋ＭＯＩ）為３進(jìn)行感染，在熒光顯微鏡下觀察ＤＣ２．４細(xì)胞中弓形蟲熒光速殖子的逡逑侵襲狀況。在鏡下我們可以觀察到，基本上每個(gè)細(xì)胞都被ＧＦＰ－ＲＨ侵入，，表明弓形蟲ＲＨ逡逑株可有效感染ＤＣ２．４細(xì)胞，而對(duì)比正常ＤＣ２．４細(xì)胞的形態(tài)，被弓形蟲感染的ＤＣ２．４細(xì)胞沒逡逑有出現(xiàn)很大的形態(tài)學(xué)變化。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．邋Ｔｈｅ邋ｉｎｖａｓｉｏｎ邋ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ邋ｏｆ邋ＤＣ２．４邋ｂｙ邋Ｔ．邋ｇｏｎｄｉｉ邋ＲＨ邋ｗａｓ邋ｅｖａｌｕａｔｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ＲＨ－ＧＦＰ邋ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．逡逑（ＭＯＩ＝３邋Ｘ４０）逡逑２０逡逑
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R382.5

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