【摘要】：【研究背景】胰島素是一種內(nèi)源性降糖激素,但外源性胰島素過量會導(dǎo)致人體嚴(yán)重毒副作用,如驚厥、角弓反張、低血糖昏迷,甚至死亡。隨著胰島素的廣泛使用,因胰島素過量造成意外、自殺、甚至他殺案件也日趨增多。國內(nèi)外報(bào)道胰島素他殺的案件已經(jīng)愈發(fā)難以控制。由于胰島素過量死亡缺乏特異性病理學(xué)改變,死后也難以進(jìn)行藥(毒)物分析,所以這個(gè)科學(xué)難題也一直困擾著國際司法鑒定領(lǐng)域,而因此,研究動物胰島素過量急性中毒半數(shù)致死量,建立胰島素過量低血糖腦損傷動物模型是研究其中毒癥狀、組織病理、死亡機(jī)制及對應(yīng)法醫(yī)鑒定對策的基礎(chǔ)及前提。胰島素中毒主要依據(jù)血液中測得的胰島素、血糖水平進(jìn)行診斷,但血胰島素、血糖水平隨著死亡時(shí)間變化而發(fā)生的死后化學(xué)變化,從而干擾其真實(shí)的濃度或含量導(dǎo)致無法應(yīng)用于法醫(yī)鑒定。由于死后紅細(xì)胞自溶釋放血紅蛋白,導(dǎo)致胰島素迅速降解、尸體血液中胰島素遠(yuǎn)低于生前實(shí)際水平;從死后尸體血中盡快提取并分離血清,可更好地保存死后血清的質(zhì)量、降低溶血的影響而被推薦于胰島素中毒的法醫(yī)鑒定。然而,在法醫(yī)病理學(xué)領(lǐng)域,用于毒理學(xué)和生化檢查的血液很少在死亡后能夠立即收集和離心。的確,在法醫(yī)尸檢案件中,獲得能夠適用于死后胰島素定量的血清樣本是一種奢望。此外,由于基質(zhì)干擾、各種循環(huán)抗體和胰島素降解酶降解胰島素,以及死后溶血的影響,死后血液中測定的胰島素的數(shù)據(jù)也不能反映死者生前的胰島素水平。因此,除非死后迅速解剖或保留死者生前血清,否則難以通過檢測尸體血液中胰島素或血糖水平進(jìn)行胰島素中毒致死的法醫(yī)學(xué)診斷。目前,低血糖腦病(hypoglycemia encephalopathy,HE)被認(rèn)為是胰島素中毒致死的主要機(jī)制。葡萄糖是大腦內(nèi)最主要的能量來源,當(dāng)血糖≤2.0 mmol/L時(shí),腦內(nèi)葡萄糖濃度接近于零,出現(xiàn)意識模糊、昏迷等,如昏迷時(shí)間超過30min,則導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)不可逆性損害。因此,本研究基于上述理論基礎(chǔ),擬首先測定胰島素急性中毒半數(shù)致死量,在此基礎(chǔ)上建立大鼠低血糖腦損傷的模型,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)首先通過研究小鼠胰島素急性中毒來觀察胰島素急性中毒對小鼠的行為影響,并且測定小鼠胰島素急性中毒半數(shù)及95%致死量,之后根據(jù)Auer等早期在Acta Neuropathold中推薦的方法,建立大鼠胰島素過量致低血糖腦損傷模型,完成后續(xù)神經(jīng)病理學(xué)研究。為全面揭示胰島素過量致低血糖腦損傷的病變機(jī)制及胰島素中毒死亡的法醫(yī)學(xué)診斷提供科學(xué)依據(jù)�！狙芯磕康摹�(1)測定小鼠胰島素急性中毒半數(shù)致死量(LD50),并推測胰島素中毒95%致死量(LD95);(2)觀察并記錄小鼠胰島素急性中毒表現(xiàn);(3)建立胰島素過量致大鼠低血糖腦損傷的模型。【研究方法】(1)測定小鼠胰島素急性中毒半數(shù)致死量(LD50):將60只昆明(KM)小鼠隨機(jī)分為6組進(jìn)行試驗(yàn),每組10只,其中雌雄各半。隨后將實(shí)驗(yàn)KM鼠進(jìn)一步分為5個(gè)劑量的胰島素急性染毒組和假手術(shù)對照組。其中急性染毒組分別給予單次0.7 IU/kg、1.9 IU/kg、4.9 IU/kg、13.0 IU/kg、34.5 IU/kg的胰島素溶液腹腔注射;對照組小鼠給予單次生理鹽水0.1ml腹腔注射;觀察小鼠胰島素急性中毒死亡的行為改變及存活率。根據(jù)上述5個(gè)染毒組(每組10只小鼠)所得的死亡率數(shù)據(jù),使用孫氏改良寇氏法(點(diǎn)斜法)及Bliss法計(jì)算小鼠腹腔注射胰島素急性中毒LD50;(2)觀察小鼠胰島素急性中毒后的行為表現(xiàn);(3)建立胰島素過量致大鼠低血糖腦損傷的模型:將55只SD(Sprague Dawley)成年的雄性大鼠隨機(jī)分為急性低血糖組、復(fù)蘇組及1個(gè)空白對照組(各9只)。根據(jù)Auer等早期在Acta Neuropathold中推薦的方法,建立大鼠胰島素過量致低血糖腦損傷模型,完成后續(xù)神經(jīng)病理學(xué)研究。(4)探討大鼠胰島素中毒大腦的病變特點(diǎn)�！窘Y(jié)果】(1)小鼠胰島素中毒的LD50:使用點(diǎn)斜法(孫氏改良寇氏法)及Bliss法計(jì)算小鼠胰島素腹腔注射急性中毒LD50,得到LD50較為接近,為10.0 IU/Kg;(2)急性中毒表現(xiàn):胰島素中毒染毒組小鼠均出現(xiàn)2種較為穩(wěn)定的癥狀,即呆滯及后肢無力。染毒后部分小鼠還出現(xiàn)如驚厥、角弓反張(表現(xiàn)為項(xiàng)背高度強(qiáng)直,使身體仰曲如弓狀的病癥)及二便失禁、昏迷等癥狀,其出現(xiàn)頻率隨時(shí)間的增長而增加;(2)神經(jīng)病理學(xué)改變:大鼠胰島素中毒模型可觀察到海馬(尤其CA1區(qū)、CA3區(qū)、齒狀回嵴)、大腦皮質(zhì)淺層(尤其第Ⅱ、Ⅲ層)等區(qū)域出現(xiàn)選擇性神經(jīng)元壞死,而海馬神經(jīng)元在病程遷延或低血糖葡萄糖再灌注后壞死更為明顯;【結(jié)論】(1)通過應(yīng)用單次0.7 IU/kg、1.9 IU/kg、4.9 IU/kg、13.0 IU/kg、34.5 IU/kg的胰島素腹腔注射染毒,計(jì)算出小鼠LD50為10.481 IU/kg,LD95為99.75 IU/kg;(2)通過應(yīng)用單次注射0.7 IU/kg、1.9 IU/kg、4.9 IU/kg、13.0 IU/kg、34.5 IU/kg的胰島素腹腔注射可以觀察到小鼠胰島素急性中毒后的行為表現(xiàn)。染毒后迅速發(fā)生的后肢無力及間歇性的驚厥、角弓反張抽搐可以作為染毒成功的表現(xiàn);(3)建立胰島素過量致低血糖腦損傷的模型,通過低血糖腦損傷神經(jīng)病理學(xué)研究,發(fā)現(xiàn)海馬損傷是胰島素過量的一個(gè)特征性病理改變,為后續(xù)低血糖腦病的研究奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

2.1 動物急性中毒表現(xiàn)表現(xiàn)大鼠注射胰島素后血糖≤3.0mmol/L 時(shí)即可出現(xiàn)呆滯、后肢無力，驚厥、輕度抽搐，肌緊張?jiān)鰪?qiáng)，部分大鼠出現(xiàn)二便失禁、嚴(yán)重抽搐。低血糖復(fù)蘇組大鼠麻醉清醒后主要表現(xiàn)為反應(yīng)遲鈍、呆滯不動、不思飲食，其癥狀隨傷后存活時(shí)間延長而緩解。本實(shí)驗(yàn)中低血糖復(fù)蘇組總體死亡率達(dá) 50%，其中復(fù)蘇后短時(shí)間內(nèi)死亡的大鼠主要表現(xiàn)為呼吸暫停后難以恢復(fù)自主呼吸。2.2 腦電圖(EEG)檢測結(jié)果胰島素注射后前期，可觀察到明顯的腦電活動。然后，觀察到高振幅慢波，其中有尖銳的波狀成分，隨后出現(xiàn)不規(guī)則或有節(jié)奏的尖波，最終出現(xiàn)等電位腦電圖即平波現(xiàn)象。在研究低血糖腦損傷時(shí)，只有當(dāng)腦電圖（EEG）長時(shí)間變?yōu)榈入娢粫r(shí),大鼠低血糖昏迷并對中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成不可逆性損傷，大腦神經(jīng)元開始死亡。

華 中 科 技 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文2.3 腦組織大體觀察肉眼觀察實(shí)驗(yàn)組組及對照組所有大鼠均未見顱骨骨折及硬膜外血腫的形成。實(shí)驗(yàn)組腦組織表面血管輕度擴(kuò)張充血。但未見蛛網(wǎng)膜下腔出血、腦挫裂傷及腦挫傷。對照組的大鼠腦組織未發(fā)現(xiàn)異常。2.4 HE 染色HE 染色結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組均表現(xiàn)為不同程度的異常，急性低血糖組（圖 2b）可見神經(jīng)元腫脹，體積增大，但未見壞死，而復(fù)蘇組（圖 2c）可見齒狀回脊顆粒神經(jīng)元的脫失，，CA1 區(qū)神經(jīng)元壞死，對照組（圖 2a）大鼠海馬區(qū)域無異常表現(xiàn)。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R-332;R595.4

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本文編號：2677137