【摘要】：目的:本實驗通過制備抗腸道病毒71型雞卵黃抗體(anti-EV71 IgY),開展其在體內(nèi)及體外抗腸道病毒71型(EV71),體外抗柯薩奇病毒A16型(CVA16)的相關(guān)檢測,并對其抗EV71和CVA16的作用機制進行探討。以期探索出一種新的能交叉被動免疫治療由EV71和CVA16引發(fā)的手足口病(HFMD)方案。方法:以EV71毒株作為抗原,與弗氏不完全佐劑1:1混合并吹打使其乳化均勻,通過多次注射來免疫SPF級母雞,收集并提取純化IgY;蛋白定量法檢測IgY的總蛋白濃度;通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)測試IgY純度;采用間接酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)來評價特異性IgY的濃度變化規(guī)律;蛋白質(zhì)印記法和免疫雙向瓊脂擴散法檢測純化IgY的特異性;采用觀測人橫紋肌肉瘤細胞(RD)的細胞病變效應(yīng)(CPE)檢測特異性IgY體外對EV71與CVA16中和能力的量效關(guān)系,抗EV71穩(wěn)定性和時效性;通過免疫熒光法檢測特異性IgY在非洲綠猴腎細胞(Vero)中的抗EV71作用;灌胃給藥檢測特異性IgY對被EV71病毒感染的新生BALB/c鼠的保護作用。結(jié)果:IgY總蛋白濃度在免疫后整體呈上升趨勢;SDS-PAGE電泳圖顯示純化的IgY純度良好,可被分裂為分子量約為70 kDa的IgY重鏈(H)及30 kDa的IgY輕鏈(L);通過ELISA我們發(fā)現(xiàn)特異性IgY濃度在免疫后的第7天出現(xiàn)增加,在第7周達到最高,并在較高水平維持4周左右;免疫雙向瓊脂擴散實驗與Western blot測得特異性IgY具有與EV71、CVA16毒株良好的免疫結(jié)合性,能特異性識別EV71和CVA16的包膜蛋白VP1及VP3;IgY體外中和病毒實驗結(jié)果顯示,特異性IgY能抑制EV71病毒和CVA16病毒的感染病變能力,并呈劑量-效應(yīng)相關(guān)關(guān)系,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;特異性IgY在感染早期對EV71病毒有很強的抑制作用,感染后期抑制效果不明顯;特異性IgY在4℃、室溫、37℃條件下48 h后抗病毒活性依然穩(wěn)定,60℃條件下1.6μg/mL仍能對病毒達到100%的抑制率。反復(fù)凍融5次后對IgY的抗病毒活性沒有影響。特異性IgY對腸道病毒EV71、CVA16有很強的抑制活性,對其他腸道病毒抑制效果不明顯;免疫熒光法顯示特異性IgY在3.72μg/mL對Vero細胞中的毒株能達到近乎100%的抑制作用;特異性IgY實驗組新生鼠生存率達到100%,相比于對照組無消瘦,精神萎靡,毛發(fā)生長異常等癥狀。結(jié)論:(1)免疫后提取的特異性IgY純度與抗病毒特異性良好。(2)特異性IgY能識別EV71、CVA16病毒的包膜蛋白VP1與VP3,在體外抗病毒實驗中能有效地抑制EV71病毒和CVA16病毒活性并呈劑量-效應(yīng)相關(guān)關(guān)系。(3)特異性IgY作用于EV71感染早期處理明顯優(yōu)于后期,并且特異性IgY的穩(wěn)定性較好。(4)特異性IgY灌胃給藥后可以對被EV71攻擊的乳鼠提供保護。
【圖文】：

24圖2 初次免疫后特異性IgY的變化規(guī)律Figure 2. The development pattern of specific IgY after primary immunization2.4 免疫雙向瓊脂擴散實驗根據(jù)免疫雙向瓊脂擴散實驗，初次免疫后第 7 周卵黃抗體的特異性如圖 A 和 B，中心 EV71 與 CVA16 毒株抗原孔與周圍以 1:2、1:4 和 1:8 稀釋的特異性 IgY 抗體孔之間出現(xiàn)了明顯的白色免疫沉淀線，而陰性對照 PBS孔與抗原孔之間沒有出現(xiàn)免疫沉淀線，表明制備的特異性 IgY 具有與 EV71和 CVA16 毒株特異結(jié)合的能力。

25圖3 免疫雙向瓊脂擴散實驗，特異性IgY對EV71毒株和CVA16毒株的免疫結(jié)合性分析。(A) EV71的雙向免疫瓊脂擴散；(B) CVA16的雙向免疫瓊脂擴散。Figure 3. Agar Double Immunodiffusion， characterization of the specific IgY against EV71 strain andCVA16 strain. (A) Bidirectional immune agar diffusion test for EV71. (B) Bidirectional immune agardiffusion test for CVA16.2.5 Western blot 蛋白檢測純化 IgY 特異性WB 結(jié)果顯示特異性 IgY 抗體在圖 A 和 B 的 1、2 泳道能特異性識別EV71 和 CVA16 病毒的 VP1（36 kDa）與 VP3（28 kDa）[51, 52]蛋白，產(chǎn)生良好的免疫結(jié)合反應(yīng)。而對照組 IgY 不能識別兩種病毒的包膜蛋白（5、6泳道），提示對照組 IgY 不具有與病毒的免疫反應(yīng)性。用商品化 VP1 單克隆抗體對 EV71 和 CVA16 抗原的 VP1 蛋白進行驗證，結(jié)果如圖 A 和 B 的第 5、6 泳道所示，，驗證了電泳后 VP1 蛋白分子量。用商品化 VP1 蛋白對制備的IgY 進行驗證，結(jié)果如圖 C
【學(xué)位授予單位】：桂林醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R392-33

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本文編號：2677081