【摘要】：一.研究背景剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii,Tgondii)是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲,能夠感染大多數(shù)溫血?jiǎng)游�。弓形蟲是頂復(fù)門原蟲的成員,由于弓形蟲的地理分布和中間宿主的多樣性,使得其成為世界上分布最廣的寄生蟲之一。弓形蟲在各種中間宿主中進(jìn)行無(wú)性增殖,包括人類在內(nèi)。在感染中間宿主時(shí),弓形蟲分化成速殖子,并迅速在宿主體內(nèi)傳播。雖然大多數(shù)速殖子被免疫系統(tǒng)清除,但一些速殖子轉(zhuǎn)變?yōu)榫徶匙?在腦和肌肉中形成相對(duì)靜止的組織包囊。在大多數(shù)免疫正常人群,弓形蟲感染為一過(guò)性甚至是無(wú)臨床表現(xiàn),而對(duì)于免疫低下人群則會(huì)造成弓形蟲眼病、弓形蟲腦病甚至死亡,對(duì)于孕婦會(huì)造成流產(chǎn)、畸胎、嚴(yán)重的先天性缺陷包括眼部疾病和發(fā)育遲緩甚至死胎等嚴(yán)重危害由于弓形蟲急性感染的危害性相對(duì)嚴(yán)重,以往的研究更多關(guān)注的是弓形蟲速殖子,而認(rèn)為在腦和肌肉中形成的相對(duì)靜止的組織包囊在宿主體內(nèi)不起作用。但近幾年的研究表明,被弓形蟲感染的嚙齒動(dòng)物表現(xiàn)出不尋常的行為反應(yīng):它們失去了對(duì)貓尿氣味的本能厭惡,反而被貓尿氣味吸引,這種行為改變看起來(lái)有利于弓形蟲由中間宿主向終宿主傳播。雖然這種行為操縱的確切機(jī)制尚不清楚,但是寄生于大腦中的弓形蟲能夠通過(guò)刺激宿主多巴胺(dopamine,DA)通路使其調(diào)控發(fā)生改變進(jìn)而操縱宿主行為已被認(rèn)為是一個(gè)可能的機(jī)制。有研究者已經(jīng)提出,速殖子在體外可以改變DA水平,腦內(nèi)包囊可以直接影響宿主大腦中的DA產(chǎn)生和DA突觸傳遞。另外,用于治療精神分裂癥的多巴胺受體拮抗劑氟哌啶醇,同時(shí)也能抑制弓形蟲增殖且用藥后患者抗弓形蟲抗體滴度水平下降。而抗精神病藥物聯(lián)合蒿甲醚治療能顯著改善精神分裂癥患者部分精神癥狀并且降低弓形蟲抗體陽(yáng)性率。這都說(shuō)明了弓形蟲感染可能與宿主腦內(nèi)多巴胺水平相關(guān),但其引起多巴胺改變的可能機(jī)制尚不清楚。在弓形蟲基因組包含兩個(gè)編碼芳香族氨基酸羥化酶:酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)的基因,TgAaaH1和TgAaaH2。酪氨酸經(jīng)化酶將酪氨酸轉(zhuǎn)化為多巴胺前體左旋多巴(3,4二羥基苯丙氨酸,L-Dopa),是后續(xù)多巴胺合成的限速步驟。有研究表明弓形蟲中編碼的芳香族氨基酸羥化酶的AAH1和AAH2基因有助于弓形蟲向貓的傳播而完成有性生殖,在弓形蟲卵囊發(fā)育中起重大作用。由于AAH2在弓形蟲速殖子中以低水平表達(dá),在緩殖子中表達(dá)上調(diào),以往更多對(duì)AAH2的功能進(jìn)行研究。有研究發(fā)現(xiàn)AAH2基因不影響弓形蟲速殖子期的功能或感染宿主腦中多巴胺的全局或區(qū)域性改變,也不影響慢性弓形蟲感染BALB/c小鼠的DA依賴性神經(jīng)異常行為。但對(duì)于AAH2基因的功能存在爭(zhēng)議沒有定論,而對(duì)于在速殖子期和緩殖子期都有相當(dāng)量表達(dá)的AAH1基因的功能研究較少。那么AAH1是否在弓形蟲的生長(zhǎng)發(fā)育中有特殊功能或者參與了寄生蟲操縱宿主DA,進(jìn)而影響宿主的行為改變?為了探究這種可能性,我們構(gòu)建了Ⅰ型RH株和Ⅱ型PRU株的AAH1基因敲除蟲株,探究AAH1基因在速殖子階段對(duì)弓形蟲入侵宿主細(xì)胞,在宿主細(xì)胞內(nèi)增殖和生長(zhǎng)的影響;并且構(gòu)建動(dòng)物模型以直接探究弓形蟲AAH1基因的敲除對(duì)弓形蟲急性感染小鼠毒力作用、弓形蟲慢性感染小鼠腦組織成囊能力的影響,以及通過(guò)監(jiān)測(cè)小鼠的行為來(lái)探究AAH1基因在弓形蟲緩殖子階段的功能。二.方法1.利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR.),構(gòu)建單拷貝pUC19-SAG1-AAH1質(zhì)粒作為基底對(duì)照,檢測(cè)AAH1基因在Ⅰ型RH株和Ⅱ型PRU株基因組中的拷貝數(shù)。2.應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù),在AAH1基因第7個(gè)外顯子定向插入乙胺嘧啶基因作為藥篩標(biāo)簽,通過(guò)插入失活,以達(dá)到敲除AAH1基因功能目的,并在基因組及轉(zhuǎn)錄組水平證明插入失活。3.通過(guò)結(jié)晶紫染色、免疫熒光染色法量化弓形蟲在體外入侵HFF細(xì)胞、以及在細(xì)胞內(nèi)增殖和生長(zhǎng)能力,通過(guò)CD-1小鼠腹腔感染速殖子建立急性小鼠感染模型,觀察弓形蟲AAH1基因敲除對(duì)感染小鼠的毒力作用的影響,來(lái)探究弓形蟲AAH1基因在速殖子期的功能。4.通過(guò)包囊經(jīng)口灌胃來(lái)建立慢性感染小鼠模型,觀察弓形蟲AAH1基因敲除株慢性感染小鼠腦組織內(nèi)包囊的空間分布,利用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和Morris 水迷宮,觀察弓形蟲AAH1基因敲除株慢性感染小鼠的行為改變,來(lái)探究弓形蟲AAH1基因在緩殖子期功能。三.結(jié)果1.AAH1基因在RH和PRU株基因組中為單拷貝。2.成功構(gòu)建RHAAAH1和PRUAAAH1敲除株。3.建立弓形蟲急性和慢性感染的CD-1小鼠模型。4.弓形蟲AAH1基因敲除不影響弓形蟲對(duì)宿主細(xì)胞的入侵,在宿主細(xì)胞內(nèi)增殖和生長(zhǎng)的能力,以及對(duì)弓形蟲急性感染小鼠的毒力作用。5.弓形蟲AAH1基因敲除會(huì)影響弓形蟲慢性感染小鼠腦腦組織整體包囊負(fù)荷和局部包囊的形成。6.弓形蟲AAH1基因敲除不影響弓形蟲慢性感染小鼠在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中的自主行為和探索行為,以及在Morris水迷宮的空間學(xué)習(xí)相關(guān)行為,但會(huì)影響弓形蟲慢性感染小鼠在Morris水迷宮中記憶保持能力。四.結(jié)論AAH1基因的敲除不影響弓形蟲Ⅰ型RH株和Ⅱ型PRU株對(duì)宿主細(xì)胞的入侵、在宿主細(xì)胞內(nèi)的增殖和生長(zhǎng)能力,以及對(duì)弓形蟲急性感染小鼠的毒力作用。同時(shí),AAH1基因的敲除不影響弓形蟲Ⅱ型PRU株慢性感染小鼠在新環(huán)境中的自主行為、探索行為以及在Morris水迷宮中的學(xué)習(xí)相關(guān)行為,但是會(huì)影響弓形蟲Ⅱ型PRU株慢性感染小鼠腦內(nèi)包囊形成能力,以及在Morris水迷宮中的記憶相關(guān)行為。
【圖文】：

AAHI基因拷貝數(shù)鑒定的技術(shù)路線圖

圖１－２邋ＡＡＨ１基因敲除蟲株構(gòu)建的技術(shù)路線圖逡逑２．２引物設(shè)計(jì)及合成逡逑本實(shí)驗(yàn)中引物均由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成，，具體見下表。逡逑表１－１本研究中所用引物逡逑Ｔａｂｌｅ邋１－１邋Ｐｒｉｍｅｒｓ邋ｕｓｅｄ邋ｉｎ邋ｔｈｉｓ邋ｓｔｕｄｙ．逡逑引物名稱邐引物序列邐ｍ逡逑ＡＡＨｌ－Ｆ邐ＣＣＣ邋ＡＡＧＣＴＴＧＧＧＡＴＧＴＧＧＣ邋ＡＧＧＣＣ邋ＡＴＴＴＴＣＧＣＴＧ逡逑擴(kuò)增ＡＡＨ１基因逡逑ＡＡＨ１－Ｒ邐ＣＧＧＧＧＴＡＣＣＣＣＧＣＴＡＣ邋ＡＧ邋Ａ邋ＡＴＧ邋ＡＴＡＴＧＣ邋ＡＡＡＴＣＣ邋ＡＴＧ逡逑ＵＣｌ邋９－ＳＡＧ邋１－Ｆ邋５’－ＣＧＧＡＡＴＴＣＣＧＣＣＡＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＡＧＴＧＣＣＣＴＡＡＡＡ邋擴(kuò)增邋ＳＡＧ１邋片段構(gòu)建逡逑ｐＵＣ邋１９－Ｓ邋ＡＧ－Ｒ邐５，－ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＧＣＣ邋ＡＴＡＣ邋ＡＡＣＴＣＴＧＴＧＣＧＴＣＧＴ－３邋’邐ｐＵＣ邋１９－ＳＡＧ邋１邋－Ａ邋ＡＨ邋１逡逑１２逡逑
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R382.5

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本文編號(hào)：2677043