【摘要】：鉀通道是功能性表達(dá)在細(xì)胞膜上允許K~+跨膜通過的離子通道,鉀通道廣泛存在于骨骼肌、心臟、神經(jīng)、胃腸道和淋巴細(xì)胞中,是目前發(fā)現(xiàn)的功能最復(fù)雜、亞型最多的一類離子通道。Kv1.3是一種電壓門控鉀通道,在淋巴細(xì)胞中高表達(dá),現(xiàn)有研究表明:Kv1.3參與了人體自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展,在自身免疫性疾病患者中,Kv1.3在外周血TEM細(xì)胞中和患處的表達(dá)量高于正常人;在多發(fā)性硬化癥、牛皮癬和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病動物模型中,Kv1.3抑制劑表現(xiàn)出對其動物模型很好的治療效果,目前已有一種Kv1.3的多肽毒素抑制劑已經(jīng)針對牛皮癬的治療進(jìn)入臨床II期。自身免疫性疾病主要包括牛皮癬、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、1-型糖尿病和克羅恩等疾病,現(xiàn)有的針對自身免疫性疾病的治療方式主要為廣譜的免疫抑制劑和抗炎藥物。雖然這些藥物在一定程度生能夠緩解自身免疫性疾病的病情,但是這些藥物也存在一個明顯的副作用,就是這些藥物沒有明確的作用靶點,在緩解病情的同時也會對身體其他組織器官造成傷害。所以,急需有明確靶點的藥物進(jìn)入自身免疫性疾病治療領(lǐng)域。雖然有許多靶向于Kv1.3的藥物已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于臨床,但在藥物的篩選上,還需要發(fā)現(xiàn)更多的親和性更強(qiáng),選擇性更好的靶向于Kv1.3的藥物。不僅如此,在Kv1.3與更多的自身免疫性疾病的關(guān)系闡述上還有待更深入的研究。本研究利用本實驗室以前從雷氏大疣蛛中發(fā)現(xiàn)的一種Kv1.3抑制劑RTX-Ⅷ展開了與自身免疫性疾病相關(guān)的研究。RTX-Ⅷ含有35個氨基酸殘基,其IC50值為36.3 nM,含有6個半胱氨酸,形成3對二硫鍵。首先通過化學(xué)合成的方式合成了RTX-Ⅷ,但由于復(fù)性產(chǎn)率較低,只占線性多肽的15%左右,故后續(xù)又采用大腸桿菌原核表達(dá)的方式獲取RTX-Ⅷ,采用PET43a(+)載體和Shuffle菌種,表達(dá)的RTX-Ⅷ具有和野生型RTX-Ⅷ同樣的活性,表達(dá)量為15 mg/L。獲取了足夠的RTX-Ⅷ用于后續(xù)自身免疫性疾病動物模型實驗。雖然RTX-Ⅷ具有對Kv1.3很好的選擇性和親和力,但RTX-Ⅷ是否對于自身免疫性疾病模型有很好的治療效果還需進(jìn)一步驗證。于是,構(gòu)建了科學(xué)家已經(jīng)證明過的Kv1.3抑制劑具有很好藥效的多發(fā)性硬化癥大鼠模型(實驗性腦脊髓炎,EAE)和K14-VEGF牛皮癬小鼠模型來評價RTX-Ⅷ的藥效。實驗結(jié)果表明:1 mg/kg的RTX-Ⅷ對EAE模型大鼠表現(xiàn)出很好的治療效果,并且能夠降低模型治療組中炎性因子的分泌;緊接著,又利用K14-VEGF牛皮癬小鼠來評價RTX-Ⅷ對牛皮癬的治療效果,結(jié)果表明:RTX-Ⅷ同樣對牛皮癬小鼠具有很好的治療效果。在RTX-Ⅷ的藥物代謝動力學(xué)和毒性實驗中,研究發(fā)現(xiàn)RTX-Ⅷ在大鼠體內(nèi)30 min時達(dá)到峰值,而在1 h時就會被降解完全,且RTX-Ⅷ主要通過大鼠的肝臟進(jìn)行代謝,少部分通過大鼠腎臟進(jìn)行代謝,即使RTX-Ⅷ通過大鼠的腎臟和肝臟進(jìn)行代謝,但是在有效劑量100倍的情況下,RTX-Ⅷ并不對小鼠的肝臟和腎臟產(chǎn)生明顯的毒副作用,并且不影響老鼠的行為學(xué)。雖然Kv1.3與多發(fā)性硬化癥、牛皮癬等自身免疫性疾病的關(guān)系已經(jīng)清楚,但Kv1.3與克羅恩病的關(guān)系還需進(jìn)一步深入研究。所以首次研究了Kv1.3與克羅恩疾病的關(guān)系。1、從臨床水平:從臨床確診為克羅恩病人和正常人的外周血中分離TEM細(xì)胞,通過膜片鉗記錄TEM細(xì)胞上Kv1.3的電流,從而計算功能性表達(dá)在膜上的Kv1.3的數(shù)量,我們發(fā)現(xiàn):在克羅恩病人中Kv1.3的表達(dá)量相比于正常人要高三倍,通過RT-qPCR檢測K1.3的mRNA在克羅恩病人和正常人的表達(dá)量,同樣發(fā)現(xiàn)在mRNA水平,在克羅恩病人中的表達(dá)量要比正常人高5倍左右,通過免疫組化檢測克羅恩病人腸粘膜和正常人腸粘膜樣本,發(fā)現(xiàn)在克羅恩病人腸粘膜中Kv1.3的表達(dá)量要高于正常人組;結(jié)果確認(rèn)Kv1.3在克羅恩病人中高表達(dá)。2、從動物模型水平:建立大鼠克羅恩疾病模型,利用RTX-Ⅷ作為藥物治療模型組大鼠,結(jié)果發(fā)現(xiàn):1 mg/kg和2 mg/kg的RTX-Ⅷ能夠在一定程度上緩解大鼠克羅恩癥狀,并且能夠在體內(nèi)降低大鼠Kv1.3在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)。RTX-Ⅷ能夠降低大鼠體內(nèi)IL-2、TNF-a、IFN-g和IL-17A等炎性因子的分泌,其藥效和臨床藥物英夫利昔單抗的藥效基本一致。結(jié)果表明:RTX-Ⅷ對克羅恩病的治療效果和英夫利昔單抗的治療效果基本一致。由于現(xiàn)有的Kv1.3的多肽毒素抑制劑已經(jīng)發(fā)現(xiàn)很多,尤其是在蝎子和�？疽褐邪l(fā)現(xiàn)了大量的Kv1.3抑制劑,而在蜘蛛毒素中發(fā)現(xiàn)的Kv1.3抑制劑很少,不僅如此,在蝎子和�？械腒v1.3多肽毒素抑制劑對Kv1.3的IC50極低,通常在皮摩爾水平,而我們發(fā)現(xiàn)的RTX-Ⅷ相比于現(xiàn)有的多肽毒素也具有很明顯的優(yōu)勢:1、現(xiàn)在進(jìn)入臨床的來自于�？械亩嚯亩舅豐hK-186,是基于�？嚯亩舅豐hK進(jìn)行修飾的多肽,進(jìn)行修飾后的ShK-186對Kv1.3的IC 50為71±4 pM,對Kv1.1的IC50為7±0.5 nM,其選擇性約為97倍。而RTX-Ⅷ對Kv1.3的IC50為36 nM,對Kv1.1的IC50大于100mM,其選擇性大于3000倍,且RTX-Ⅷ為未經(jīng)任何修飾改構(gòu)的天然多肽,其選擇性明顯要優(yōu)于ShK-186。2、ShK-186的修飾是在ShK的C端偶聯(lián)上酰胺化合物,在第23個氨基酸改為甲硫氨酸,在N端加上一個磷酸化的酪氨酸,所以其樣品的獲得一定得依賴化學(xué)合成獲得,而又因為本身含有三對二硫鍵,又要對合成的樣品進(jìn)行二硫鍵的連接。而RTX-Ⅷ可以通過基因工程表達(dá)獲得大量的樣品。所以,在樣品的獲得上,RTX-Ⅷ具有比ShK-186更大的優(yōu)勢。綜上所述,本研究通過原核表達(dá)成功表達(dá)了Kv1.3的多肽抑制劑RTX-Ⅷ,并證明RTX-Ⅷ在EAE和牛皮癬動物模型中表現(xiàn)出很好的治療效果,首次闡述了Kv1.3與克羅恩疾病的關(guān)系,并證明了Kv1.3抑制劑在大鼠克羅恩疾病模型中表現(xiàn)出很好的治療效果,豐富了人們對克羅恩與Kv1.3的關(guān)系的認(rèn)識。
【圖文】：

圖 1. Kv1.2 通道蛋白質(zhì)晶體 X 射線衍射及三級結(jié)構(gòu)。A：Kv1.2 通道蛋白質(zhì)晶體 X 射線射。白色為晶格，，藍(lán)色顯示電子密度。B：Kv1.2 通道結(jié)構(gòu)示意圖。紅色為 亞基，藍(lán)色為 基[27]。

圖 1. Kv1.2 通道蛋白質(zhì)晶體 X 射線衍射及三級結(jié)構(gòu)。A：Kv1.2 通道蛋白質(zhì)晶體 X 射線射。白色為晶格，藍(lán)色顯示電子密度。B：Kv1.2 通道結(jié)構(gòu)示意圖。紅色為 亞基，藍(lán)色為 基[27]。
【學(xué)位授予單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R965;R-332

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本文編號：2674466