【摘要】：鉀通道是功能性表達(dá)在細(xì)胞膜上允許K~+跨膜通過的離子通道,鉀通道廣泛存在于骨骼肌、心臟、神經(jīng)、胃腸道和淋巴細(xì)胞中,是目前發(fā)現(xiàn)的功能最復(fù)雜、亞型最多的一類離子通道。Kv1.3是一種電壓門控鉀通道,在淋巴細(xì)胞中高表達(dá),現(xiàn)有研究表明:Kv1.3參與了人體自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展,在自身免疫性疾病患者中,Kv1.3在外周血TEM細(xì)胞中和患處的表達(dá)量高于正常人;在多發(fā)性硬化癥、牛皮癬和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病動(dòng)物模型中,Kv1.3抑制劑表現(xiàn)出對(duì)其動(dòng)物模型很好的治療效果,目前已有一種Kv1.3的多肽毒素抑制劑已經(jīng)針對(duì)牛皮癬的治療進(jìn)入臨床II期。自身免疫性疾病主要包括牛皮癬、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、1-型糖尿病和克羅恩等疾病,現(xiàn)有的針對(duì)自身免疫性疾病的治療方式主要為廣譜的免疫抑制劑和抗炎藥物。雖然這些藥物在一定程度生能夠緩解自身免疫性疾病的病情,但是這些藥物也存在一個(gè)明顯的副作用,就是這些藥物沒有明確的作用靶點(diǎn),在緩解病情的同時(shí)也會(huì)對(duì)身體其他組織器官造成傷害。所以,急需有明確靶點(diǎn)的藥物進(jìn)入自身免疫性疾病治療領(lǐng)域。雖然有許多靶向于Kv1.3的藥物已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于臨床,但在藥物的篩選上,還需要發(fā)現(xiàn)更多的親和性更強(qiáng),選擇性更好的靶向于Kv1.3的藥物。不僅如此,在Kv1.3與更多的自身免疫性疾病的關(guān)系闡述上還有待更深入的研究。本研究利用本實(shí)驗(yàn)室以前從雷氏大疣蛛中發(fā)現(xiàn)的一種Kv1.3抑制劑RTX-Ⅷ展開了與自身免疫性疾病相關(guān)的研究。RTX-Ⅷ含有35個(gè)氨基酸殘基,其IC50值為36.3 nM,含有6個(gè)半胱氨酸,形成3對(duì)二硫鍵。首先通過化學(xué)合成的方式合成了RTX-Ⅷ,但由于復(fù)性產(chǎn)率較低,只占線性多肽的15%左右,故后續(xù)又采用大腸桿菌原核表達(dá)的方式獲取RTX-Ⅷ,采用PET43a(+)載體和Shuffle菌種,表達(dá)的RTX-Ⅷ具有和野生型RTX-Ⅷ同樣的活性,表達(dá)量為15 mg/L。獲取了足夠的RTX-Ⅷ用于后續(xù)自身免疫性疾病動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)。雖然RTX-Ⅷ具有對(duì)Kv1.3很好的選擇性和親和力,但RTX-Ⅷ是否對(duì)于自身免疫性疾病模型有很好的治療效果還需進(jìn)一步驗(yàn)證。于是,構(gòu)建了科學(xué)家已經(jīng)證明過的Kv1.3抑制劑具有很好藥效的多發(fā)性硬化癥大鼠模型(實(shí)驗(yàn)性腦脊髓炎,EAE)和K14-VEGF牛皮癬小鼠模型來評(píng)價(jià)RTX-Ⅷ的藥效。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:1 mg/kg的RTX-Ⅷ對(duì)EAE模型大鼠表現(xiàn)出很好的治療效果,并且能夠降低模型治療組中炎性因子的分泌;緊接著,又利用K14-VEGF牛皮癬小鼠來評(píng)價(jià)RTX-Ⅷ對(duì)牛皮癬的治療效果,結(jié)果表明:RTX-Ⅷ同樣對(duì)牛皮癬小鼠具有很好的治療效果。在RTX-Ⅷ的藥物代謝動(dòng)力學(xué)和毒性實(shí)驗(yàn)中,研究發(fā)現(xiàn)RTX-Ⅷ在大鼠體內(nèi)30 min時(shí)達(dá)到峰值,而在1 h時(shí)就會(huì)被降解完全,且RTX-Ⅷ主要通過大鼠的肝臟進(jìn)行代謝,少部分通過大鼠腎臟進(jìn)行代謝,即使RTX-Ⅷ通過大鼠的腎臟和肝臟進(jìn)行代謝,但是在有效劑量100倍的情況下,RTX-Ⅷ并不對(duì)小鼠的肝臟和腎臟產(chǎn)生明顯的毒副作用,并且不影響老鼠的行為學(xué)。雖然Kv1.3與多發(fā)性硬化癥、牛皮癬等自身免疫性疾病的關(guān)系已經(jīng)清楚,但Kv1.3與克羅恩病的關(guān)系還需進(jìn)一步深入研究。所以首次研究了Kv1.3與克羅恩疾病的關(guān)系。1、從臨床水平:從臨床確診為克羅恩病人和正常人的外周血中分離TEM細(xì)胞,通過膜片鉗記錄TEM細(xì)胞上Kv1.3的電流,從而計(jì)算功能性表達(dá)在膜上的Kv1.3的數(shù)量,我們發(fā)現(xiàn):在克羅恩病人中Kv1.3的表達(dá)量相比于正常人要高三倍,通過RT-qPCR檢測(cè)K1.3的mRNA在克羅恩病人和正常人的表達(dá)量,同樣發(fā)現(xiàn)在mRNA水平,在克羅恩病人中的表達(dá)量要比正常人高5倍左右,通過免疫組化檢測(cè)克羅恩病人腸粘膜和正常人腸粘膜樣本,發(fā)現(xiàn)在克羅恩病人腸粘膜中Kv1.3的表達(dá)量要高于正常人組;結(jié)果確認(rèn)Kv1.3在克羅恩病人中高表達(dá)。2、從動(dòng)物模型水平:建立大鼠克羅恩疾病模型,利用RTX-Ⅷ作為藥物治療模型組大鼠,結(jié)果發(fā)現(xiàn):1 mg/kg和2 mg/kg的RTX-Ⅷ能夠在一定程度上緩解大鼠克羅恩癥狀,并且能夠在體內(nèi)降低大鼠Kv1.3在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)。RTX-Ⅷ能夠降低大鼠體內(nèi)IL-2、TNF-a、IFN-g和IL-17A等炎性因子的分泌,其藥效和臨床藥物英夫利昔單抗的藥效基本一致。結(jié)果表明:RTX-Ⅷ對(duì)克羅恩病的治療效果和英夫利昔單抗的治療效果基本一致。由于現(xiàn)有的Kv1.3的多肽毒素抑制劑已經(jīng)發(fā)現(xiàn)很多,尤其是在蝎子和�？疽褐邪l(fā)現(xiàn)了大量的Kv1.3抑制劑,而在蜘蛛毒素中發(fā)現(xiàn)的Kv1.3抑制劑很少,不僅如此,在蝎子和�？械腒v1.3多肽毒素抑制劑對(duì)Kv1.3的IC50極低,通常在皮摩爾水平,而我們發(fā)現(xiàn)的RTX-Ⅷ相比于現(xiàn)有的多肽毒素也具有很明顯的優(yōu)勢(shì):1、現(xiàn)在進(jìn)入臨床的來自于海葵中的多肽毒素ShK-186,是基于�？嚯亩舅豐hK進(jìn)行修飾的多肽,進(jìn)行修飾后的ShK-186對(duì)Kv1.3的IC 50為71±4 pM,對(duì)Kv1.1的IC50為7±0.5 nM,其選擇性約為97倍。而RTX-Ⅷ對(duì)Kv1.3的IC50為36 nM,對(duì)Kv1.1的IC50大于100mM,其選擇性大于3000倍,且RTX-Ⅷ為未經(jīng)任何修飾改構(gòu)的天然多肽,其選擇性明顯要優(yōu)于ShK-186。2、ShK-186的修飾是在ShK的C端偶聯(lián)上酰胺化合物,在第23個(gè)氨基酸改為甲硫氨酸,在N端加上一個(gè)磷酸化的酪氨酸,所以其樣品的獲得一定得依賴化學(xué)合成獲得,而又因?yàn)楸旧砗腥龑?duì)二硫鍵,又要對(duì)合成的樣品進(jìn)行二硫鍵的連接。而RTX-Ⅷ可以通過基因工程表達(dá)獲得大量的樣品。所以,在樣品的獲得上,RTX-Ⅷ具有比ShK-186更大的優(yōu)勢(shì)。綜上所述,本研究通過原核表達(dá)成功表達(dá)了Kv1.3的多肽抑制劑RTX-Ⅷ,并證明RTX-Ⅷ在EAE和牛皮癬動(dòng)物模型中表現(xiàn)出很好的治療效果,首次闡述了Kv1.3與克羅恩疾病的關(guān)系,并證明了Kv1.3抑制劑在大鼠克羅恩疾病模型中表現(xiàn)出很好的治療效果,豐富了人們對(duì)克羅恩與Kv1.3的關(guān)系的認(rèn)識(shí)。
【圖文】：

圖 1. Kv1.2 通道蛋白質(zhì)晶體 X 射線衍射及三級(jí)結(jié)構(gòu)。A：Kv1.2 通道蛋白質(zhì)晶體 X 射線射。白色為晶格，，藍(lán)色顯示電子密度。B：Kv1.2 通道結(jié)構(gòu)示意圖。紅色為 亞基，藍(lán)色為 基[27]。

圖 1. Kv1.2 通道蛋白質(zhì)晶體 X 射線衍射及三級(jí)結(jié)構(gòu)。A：Kv1.2 通道蛋白質(zhì)晶體 X 射線射。白色為晶格，藍(lán)色顯示電子密度。B：Kv1.2 通道結(jié)構(gòu)示意圖。紅色為 亞基，藍(lán)色為 基[27]。
【學(xué)位授予單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R965;R-332

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本文編號(hào)：2674466